秦雪，劉真，王璟，仝令印，孫?；?/p>

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生理學(xué)教研室，濟(jì)南250014）

1 引 言

束縛—浸水應(yīng)激（restraint water-immersion stress，RWIS）作為一種復(fù)合應(yīng)激模型對(duì)軀體和心理方面有較大的刺激強(qiáng)度。該模型可在短時(shí)間內(nèi)使大鼠情緒暴躁、體溫下降并導(dǎo)致胃腸機(jī)能發(fā)生紊亂，如產(chǎn)生急性胃黏膜損傷[1]。許多研究證明，腦內(nèi)多個(gè)核團(tuán)和區(qū)域參與胃機(jī)能的調(diào)節(jié)。其中，位于延髓的DMV、NTS作為迷走復(fù)合體的組成部分，是調(diào)控胃機(jī)能的副交感初級(jí)中樞。

應(yīng)激條件下，F(xiàn)os蛋白的表達(dá)一般被認(rèn)為是神經(jīng)元激活的標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，RWIS不同時(shí)段，大鼠NTS、DMV等部位的Fos表達(dá)發(fā)生了不同程度的變化[2]，說(shuō)明其參與了束縛—浸水應(yīng)激反應(yīng)。腦和脊髓中存在大量星形膠質(zhì)細(xì)胞，其中膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）是其重要組成成分[3]，而引起星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的標(biāo)志就是GFAP表達(dá)的增強(qiáng)。在一側(cè)脛腓骨骨折的即刻應(yīng)激反應(yīng)模型中，延髓內(nèi)臟帶、中縫大核等有明顯的GFAP陽(yáng)性表達(dá)，并且與Fos蛋白的分布基本一致[4]。但對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與RWIS的研究還未曾報(bào)道。已有研究表明，在應(yīng)激條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)和功能方面的可塑性對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)起到重要的作用。段麗等人[5]的研究表明，視上核（SON）內(nèi)神經(jīng)元是通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)對(duì)高滲刺激作出反應(yīng)。如果神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞都參與RWIS，那兩者之間的關(guān)系是相互促進(jìn)還是相互抑制目前尚不清楚。L-AA是一種谷氨酸類(lèi)似物，它可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，但不直接抑制神經(jīng)元的表達(dá)。有研究表明，向脊髓鞘內(nèi)注射L-AA后，可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓背角的表達(dá)；而且神經(jīng)元的表達(dá)也明顯減少。此外，大鼠經(jīng)L-AA預(yù)先處理，可顯著抑制高滲刺激下視上核星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元Fos蛋白的表達(dá)也起到了抑制作用[6]。那么，L-AA預(yù)先處理的大鼠，在RWIS條件下，是否會(huì)影響NTS和DMV核團(tuán)內(nèi)神經(jīng)元Fos的表達(dá)目前尚未有研究。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是體重分別為220～250 g和250～300 g雄性Wistar大鼠，購(gòu)于山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。兔c-Fos由美國(guó)Santa Cruz公司提供；兔抗GFAP由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，兩者均由PBS、10%Triton X-100和10%NGS稀釋?zhuān)徽Ｉ窖蜓?；SP系列試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司；L-α-aminoadipate，L-AA購(gòu)于Aladdin試劑有限公司，由生理鹽水稀釋。

2.2 動(dòng)物分組與模型制備

（1）將36只體重為220～250 g雄性 Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為束縛浸水應(yīng)激 0.5、1、2、3、5 h五個(gè)亞組，每組各 6只，正式實(shí)驗(yàn)前24 h饑餓處理。應(yīng)激組大鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，背向木板固定四肢，10min后將其豎直放于冷水（21±1℃）中，水位達(dá)胸骨劍突處。對(duì)照組不進(jìn)行束縛—浸水處理。（2）將12只體重為250～300 g大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和L-AA組各6只，按大鼠體重，以5 ml／kg的4%水合氯醛麻醉大鼠，側(cè)腦室定位（前囟后0.96 mm，旁開(kāi)1.8 mm，硬腦膜下3.5mm）埋管，手術(shù)后連續(xù)兩天注射青霉素消炎，恢復(fù)三天，正式實(shí)驗(yàn)前24 h禁食。大鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后，背向木板固定四肢，微量注射器側(cè)腦室注射10μl生理鹽水或者L-AA。10 min后將其豎直放于冷水（21±1℃）中1 h，水位達(dá)胸骨劍突處。為避免晝夜節(jié)律影響應(yīng)激反應(yīng)，所有束縛—浸水處理過(guò)程均在上午7時(shí)至12時(shí)進(jìn)行。

2.3 胃黏膜損傷的評(píng)估

RWIS結(jié)束后，腹腔注射過(guò)量4%水合氯醛，將胃從腹腔取出后用4%多聚甲醛溶液固定40 min。將胃沿胃大彎剪開(kāi)沖洗干凈，解剖鏡下（10×）觀察胃黏膜損傷程度。胃黏膜損傷程度用Guth計(jì)數(shù)法計(jì)算后采用損傷指數(shù)（EI）表示。

2.4 組織準(zhǔn)備

大鼠取出胃后，依次用0.01mol／l的PBS，pH＝7.4和4℃的多聚甲醛，pH＝7.4經(jīng)心臟全身灌流固定、取腦，置于多聚甲醛中4℃冰箱后固定4 h，隨后放入30%的蔗糖溶液中脫水過(guò)夜。腦沉底后用冰凍切片機(jī)對(duì)延髓進(jìn)行片厚20μm的冠狀切片，將切好的腦片放在 PBS（0.01 mol／l）中備用。

2.5 免疫組織化學(xué)染色

將兩套相同切片漂洗后加入30%的過(guò)氧化氫／甲醇溶液，室溫孵育30 min，消除內(nèi)源性酶的活性；含10%正常羊血清和10%TritonX-1000的PBS 0.01mol／l pH＝7.4，室溫孵育 30 min；加入兔抗 GFAP抗體（1：500）或兔抗 c-fos抗體（1：600），4℃孵育24 h；再依次加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫下各孵育2 h；DAB顯色液避光顯色5 min；各步驟之間均用PBS漂洗，將腦片貼在明膠處理的載玻片上，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。

2.6 顯微拍照計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

借助顯微鏡觀察DMV和NTS中GFAP或者Fos-IR神經(jīng)元表達(dá)情況；其吻端、中端和尾端GFAP或者 Fos-IR神經(jīng)元的個(gè)數(shù)（個(gè)數(shù)／0.01 mm2）用Image pro-Plus 6.0圖象分析軟件統(tǒng)計(jì)。均數(shù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)處理用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，用雙尾獨(dú)立性樣本t-檢驗(yàn)比較組間均數(shù)，用單因素方差分析和S-N-K多重比較進(jìn)行吻端、中端、尾端間的均數(shù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 束縛-浸水應(yīng)激不同時(shí)間段對(duì)胃黏膜損傷和GFAP表達(dá)的影響

3.1.1 胃潰瘍指數(shù)統(tǒng)計(jì) 與對(duì)照組相比，胃潰瘍指數(shù)在應(yīng)激組各時(shí)段均有極顯著差異，P＜0.01，見(jiàn)圖1。隨著應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，胃潰瘍指數(shù)顯著升高，胃黏膜損傷由對(duì)照組的光滑完整變?yōu)槌霈F(xiàn)點(diǎn)狀血斑，甚至出現(xiàn)條狀血斑，見(jiàn)圖2。

圖1 對(duì)照組和應(yīng)激組各時(shí)段胃潰瘍指數(shù)的比較（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig 1 The gastric ulcer index of the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖2 RW IS不同時(shí)間段對(duì)胃黏膜損傷的比較A：對(duì)照組；B：RWIS 0.5小時(shí)組；C：RWIS 1小時(shí)組；D：RWIS 2小時(shí)組；E：RWIS 3小時(shí)組；F：RWIS 5小時(shí)組。Fig 2 Gastric mucosa of the unstressed and stressed ratsA：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group.

3.1.2 NTS和DMV不同區(qū)段GFAP的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，應(yīng)激組各時(shí)段NTS和DMV不同區(qū)段GFAP表達(dá)增加，細(xì)胞突起增多。見(jiàn)圖3。GFAP分布在NTS和DMV的吻-尾全段，應(yīng)激1 h時(shí)，NTS和DMV三個(gè)區(qū)段的GFAP表達(dá)均達(dá)到高峰，之后GFAP表達(dá)有所下降，但與對(duì)照組相比仍有顯著差異，見(jiàn)圖4、圖5、圖6。

圖3 對(duì)照組和應(yīng)激 0.5、1、2、3、5h組 NTS和 DMV不同區(qū)段GFAP的表達(dá)各應(yīng)激組與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 A：NTS不同區(qū)段GFAP表達(dá)；B：DMV不同區(qū)段GFAP表達(dá)。Fig 3 GFAP expression in different sections of the DMV and NTS in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h RatsEach stress group compared with control group，*P＜0.05，**P＜0.01 A：GFAP expression in different sections of the NTS；B：GFAP expression in different sections of the DMV

3.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑L-AA對(duì)胃黏膜損傷和GFAP及Fos表達(dá)的影響

3.2.1 給藥處理胃潰瘍指數(shù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)激1 h，與生理鹽水對(duì)照組相比，注射L-AA組胃潰瘍指數(shù)降低，P＜0.05，見(jiàn)圖7。生理鹽水對(duì)照組胃黏膜損傷程度較為嚴(yán)重，出現(xiàn)條索狀血斑。而注射L-AA組，胃黏膜表面只有少數(shù)潰瘍斑點(diǎn)，損傷較輕，見(jiàn)圖8。

圖4 對(duì)照組和RW IS不同時(shí)段組GFAP在大鼠NTS、DMV吻端的表達(dá)（×200）A：對(duì)照組；B：RWIS 0.5小時(shí)組；C：RWIS 1小時(shí)組；D：RWIS 2小時(shí)組；E：RWIS 3小時(shí)組；F：RWIS 5小時(shí)組。Fig.4 GFAP expression in the rostral portion of the NTS and DMV in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（×200）A：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group.

圖5 對(duì)照組和RW IS不同時(shí)段組GFAP在大鼠NTS、DMV中端的表達(dá)（×200）A：對(duì)照組；B：RWIS 0.5小時(shí)組；C：RWIS 1小時(shí)組；D：RWIS 2小時(shí)組；E：RWIS 3小時(shí)組；F：RWIS 5小時(shí)組。Fig 5 GFAP expression in the intermediate portion of the NTS and DMV in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（×200）A：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group

3.2.2 給藥處理GFAP和Fos在NTS和DMV不同區(qū)段的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，相比生理鹽水對(duì)照組，使用L-AA抑制劑后，GFAP在NTS和DMV各個(gè)區(qū)段的表達(dá)明顯減少，同時(shí)神經(jīng)元標(biāo)記物Fos表達(dá)也顯著減少，說(shuō)明L-AA可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖9、圖 10、圖11。

圖6 對(duì)照組和RW IS不同時(shí)段組GFAP在大鼠 NTS、DMV尾端的表達(dá)（×200）A：對(duì)照組；B：RWIS 0.5小時(shí)組；C：RWIS 1小時(shí)組；D：RWIS 2小時(shí)組；E：RWIS 3小時(shí)組；F：RWIS 5小時(shí)組。Fig 6 GFAP expression in the caudal portion of the NTS and DMV in the unstressed and stressed 0.5，1，2，3，5h rats（×200）A：Unstressed group；B：RWIS 0.5h group；C：RWIS 1h group；D：RWIS 2h group；E：RWIS 3h group；F：RWIS 5h group

圖7 生理鹽水對(duì)照組和注射L-AA組對(duì)胃潰瘍指數(shù)的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）Fig 7 The gastric ulcer index of the saline and L-AA rats（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖8 生理鹽水組、L-AA組大鼠胃粘膜A：生理鹽水組；B：L-AA組。Fig 8 Gastric mucosa of the saline and L-AA ratsA：saline group；B：L-AA group

圖9 生理鹽水對(duì)照組和L-AA給藥處理NTS和DMV不同區(qū)段GFAP和Fos的表達(dá)給藥組與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 A：NTS區(qū)段GFAP表達(dá)；B：DMV區(qū)段GFAP表達(dá)；C：NTS區(qū)段Fos表達(dá)；D：DMV區(qū)段Fos表達(dá)。Fig 9 GFAP and Fos expression in different sections of the DMV and NTS of the saline and L-AA rats.L-AA group compared with saline group，*P＜0.05，**P＜0.01 A：GFAP expression in the NTS；B：GFAP expression in the DMV；C：Fos expression in the NTS；D：Fos expression in the DMV

圖10 生理鹽水組和L-AA組大鼠NTS、DMV不同區(qū)段Fos表達(dá)（×100）A：生理鹽水組；B：L-AA組；a：吻端；b：中端；c：尾端。Fig 10 Fos expression in different sections of the NTS and DMV in the saline and L-AA rats（×100）A：saline group；B：L-AA group；a：rostral；b：intermediate；c：caudal

圖11 生理鹽水組和L-AA組大鼠NTS、DMV不同區(qū)段GFAP的表達(dá)（×200）A：生理鹽水組；B：L-AA組；a：吻端；b：中端；c：尾端。Fig 11 GFAP expression in the different sections of the NTS and DMV in the saline and L-AA rats（×200）A：saline group；B：L-AA group；a：rostral；b：intermediate；c：caudal.

4 討論

NTS和DMV是迷走復(fù)合體的組成部分，是調(diào)控胃機(jī)能的低級(jí)中樞[7]。對(duì)大鼠進(jìn)行RWIS后，來(lái)自胃腸道的感覺(jué)信息經(jīng)迷走傳入神經(jīng)傳導(dǎo)至孤束核，傳入纖維的終末通過(guò)NTS內(nèi)的神經(jīng)元終末進(jìn)入腦干[8-9]。這些傳入信號(hào)經(jīng)NTS整合后，主要利用谷氨酸、GABA或者去甲腎上腺素（NE）作為神經(jīng)遞質(zhì)傳遞到相鄰的DMV，與DMV中支配胃腸的膽堿能神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系。DMV支配胃的膽堿能神經(jīng)元釋放興奮性（乙酰膽堿）或者抑制性（非膽堿能NANC）遞質(zhì)[10-12]。本實(shí)驗(yàn)室張玉玉等人的研究表明，大鼠NTS、DMV中Fos蛋白在RWIS條件下明顯增加，表明大鼠NTS和DMV參與了RWIS。神經(jīng)組織是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是體積最大的膠質(zhì)細(xì)胞，許多研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在一些應(yīng)激反應(yīng)中起到重要的作用。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein GFAP）本身是腦和脊髓中成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)組成成分[13]，屬于中間絲蛋白，有研究指出，在受到急性刺激時(shí)，海馬、下丘腦、杏仁核和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)里星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放神經(jīng)遞質(zhì)參與了急性應(yīng)激反應(yīng)[14]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在RWIS 1h時(shí)，NTS和DMV中GFAP表達(dá)都達(dá)到高峰。1 h后GFAP表達(dá)減弱，但與對(duì)照組比仍有顯著差異。表明RWIS激活了NTS、DMV中的星形膠質(zhì)細(xì)胞，參與了RWIS反應(yīng)。

孤束核經(jīng)矢狀切可分為吻端、中端和尾端三部分，吻端（前囟-12.96～-13.32 mm）、中端（前囟-13.80～-14.04 mm）和尾端（前囟-14.52～-14.76 mm），各段約占 NTS全長(zhǎng)的1／3。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，GFAP分布在NTS吻-尾全段。與對(duì)照組相比，RWIS 1h，NTS中GFAP表達(dá)達(dá)到高峰，其中，吻端2.42±0.1（個(gè)／0.01 mm2）是對(duì)照組 1.39±0.03（個(gè)／0.01 mm2）的1.74倍；中端2.66±0.08（個(gè)／0.01mm2）是對(duì)照組 1.18±0.05（個(gè)／0.01 mm2）的2.25倍；尾端 2.68±0.08（個(gè)／0.01 mm2）是對(duì)照組 1.46±0.04（個(gè)／0.01mm2）的 1.83倍。可見(jiàn)，NTS三個(gè)區(qū)段相比，GFAP在尾段和中段表達(dá)較多，這可能是NTS三個(gè)區(qū)段的不同功能影響了GFAP的表達(dá)分布，迷走神經(jīng)的大量?jī)?nèi)臟傳入主要與NTS尾段和中段相關(guān)，而吻段則主要負(fù)責(zé)接受味覺(jué)傳入。DMV經(jīng)矢狀切也可分為吻端、中端和尾端三部分，位置與NTS大致一樣。GFAP分布在DMV吻-尾全段。與對(duì)照組相比，RWIS 1h，DMV中GFAP表達(dá)達(dá)到高峰，其中，吻端2.92±0.11（個(gè)／0.01 mm2）是對(duì)照組 1.67±0.1（個(gè)／0.01 mm2）的1.75倍；中端 2.31±0.13（個(gè)／0.01 mm2）是對(duì)照組0.93±0.07（個(gè)／0.01 mm2）的2.49倍；尾端4.31±0.09（個(gè)／0.01 mm2）是對(duì)照組2.43±0.12（個(gè)／0.01 mm2）的1.77倍?？梢?jiàn)，在DMV的三個(gè)區(qū)段，中段GFAP表達(dá)最強(qiáng)烈。這可能與DMV中段的功能有關(guān)，DMV中段存在迷走節(jié)前神經(jīng)元支配胃的不同部位，因此形成了一個(gè)特定的胃代表區(qū)[15]。GFAP在中段表達(dá)最強(qiáng)烈，這可能是由于支配胃的興奮性神經(jīng)元主要分布于DMV中段及吻段內(nèi)側(cè)區(qū)域[16-17]，而DMV尾段是支配胃的迷走抑制通路的起源處。

我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)RWIS導(dǎo)致NTS和DMV中神經(jīng)元的Fos表達(dá)明顯增加，表明NTS和DMV中神經(jīng)元參與RWIS過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)NTS和DMV中的星形膠質(zhì)細(xì)胞也被激活，參與RWIS過(guò)程。那么NTS和DMV中星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元激活是否存在著調(diào)節(jié)作用。高蓓等人的研究[6]指出，在急性腹腔高滲刺激模型中，向大鼠腹腔注射高濃度的鹽水，視上核中的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞均明顯增加。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞被抑制劑抑制表達(dá)后，F(xiàn)os陽(yáng)性神經(jīng)元在視上核中的表達(dá)顯著減少，證明視上核中神經(jīng)元對(duì)刺激的反應(yīng)是通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài)介導(dǎo)的。

L-AA是一種谷氨酸類(lèi)似物，能夠特異性地抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP表達(dá)，但對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)影響較小。注射L-AA后明顯抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)，同時(shí)NTS和DMV中Fos表達(dá)均有極顯著減少。提示，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與調(diào)節(jié)RWIS狀態(tài)下的神經(jīng)元激活。本研究中，L-AA處理組抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)后，能夠顯著抑制應(yīng)激性胃潰瘍。其機(jī)制可能是在RWIS狀態(tài)下，NTS和DMV中星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元的活性，而影響了胃機(jī)能的紊亂，導(dǎo)致應(yīng)激性胃潰瘍的產(chǎn)生。綜上所述，在RWIS狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的激活，參與了束縛浸水應(yīng)激，影響了胃腸機(jī)能，導(dǎo)致胃黏膜損傷。