霍朝霞，伍亞紅，陳建忠，朱巧昀，梁星光，楊升華，黃明珠

(1.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中心實驗室，浙江 杭州　310003；2.浙江大學免疫學研究所，浙江 杭州　310058)

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MTHFRC677T多態(tài)性與消化系統(tǒng)癌癥及冠心病易感性的關系

霍朝霞1，伍亞紅1，陳建忠2，朱巧昀1，梁星光1，楊升華1，黃明珠1

(1.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中心實驗室，浙江 杭州310003；2.浙江大學免疫學研究所，浙江 杭州310058)

目的：探討浙江地區(qū)漢族人群亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T位點多態(tài)性與癌癥及冠心病易感性的關系。方法：選取確診的消化系統(tǒng)癌癥(包括胃癌、結腸癌、直腸癌及食管癌)患者、冠心病患者以及健康體檢者各100例的全血標本，提取血基因組DNA，采用Real-time PCR和測序兩種方法檢測MTHFR位點的基因多態(tài)性。結果：癌癥組的MTHFR基因野生型C/C、雜合基因型C/T及純合變異型T/T的基因型頻率分別為34%、46%和20%，冠心病組為32%、53%和15%，健康對照組為34%、54%和12%。與正常對照組相比，消化系統(tǒng)癌癥或冠心病患者MTHFRC677T各基因型的分布均無顯著性差異(P>0.05)。結論：在浙江地區(qū)人群中，未發(fā)現MTHFR基因C677T多態(tài)性與消化系統(tǒng)癌癥或冠心病的易感性存在顯著相關性。

亞甲基四氫葉酸還原酶；C677T多態(tài)性；消化道癌癥；冠心病

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)在葉酸代謝通路中發(fā)揮著重要的生物學作用，可將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸可間接為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基，進而參與同型半胱氨酸的重新甲基化過程，使血液中的同型半胱氨酸(Hcy)保持在一個正常的水平。因此，MTHFR基因的缺陷或突變會導致甲硫氨酸代謝異常，血液中同型半胱氨酸水平增高，促使心血管疾病如冠心病的發(fā)生[1]。此外，MTHFR基因缺陷或突變也會導致機體多個基礎生化過程發(fā)生紊亂，包括細胞周期調控、DNA復制及甲基化修飾異常等，進而引發(fā)癌癥等多種疾病[2]。研究發(fā)現，MTHFR基因的堿基突變，如第4外顯子的C677T位點的突變是最常見的，是引起四氫葉酸還原酶缺乏或活性下降的最常見原因。已有報道表明MTHFR基因C677T的突變，導致其酶活性下降、DNA甲基化異常從而促進了癌癥的發(fā)生[3]。多項研究也證實MTHFR基因的多態(tài)性與肺癌、胰腺癌、急性淋巴細胞白血病、子宮內膜癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、結直腸癌、胃癌及肝癌等的易感性存在密切聯系[4-9]。但報道顯示，不同國家、地區(qū)、民族間人群中MTHFRC677T突變頻率均存在差異。Yang等[10]通過調查研究10個省和直轄市漢族人口的MTHFRC677T多態(tài)性分布，發(fā)現南北方不同地域及同一省市不同地區(qū)之間均存在顯著差異，變異頻率由南至北逐漸升高。此外，MTHFR基因C677T多態(tài)性同這些疾病的相關性報道也不盡相同[11]。因此，我們選取了浙江地區(qū)的消化系統(tǒng)癌癥和冠心病患者來進一步探索MTHFR基因多態(tài)性與該類疾病易感性的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2014年7月20日至8月15日浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院腫瘤外科確診的胃癌、結腸癌、直腸癌和食管癌患者共100例，心內科冠心病確診患者100例及健康體檢者100例。入選者均為浙江省的漢族居民，且相互間無血緣關系。健康對照組的心電圖、超聲心動圖及血液生化檢查均正常，排除高血壓、糖尿病、腎功能不全及癌癥等疾病。樣品為500 μL外周血，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1試劑及儀器AllMag?全血基因組DNA提取試劑盒(上海奧潤微納新材料科技有限公司)、MTHFRC677T突變測定試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)、熒光定量PCR儀(ABI7500)。

1.2.2DNA提取用DNA提取試劑盒按說明書操作提取DNA，DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3基因分型熒光定量PCR法：用熒光定量PCR技術檢測研究對象的MTHFR基因型，所用試劑為MTHFRC677T突變測定試劑盒。反應體系為40 μL：MTHFRC677T突變熒光PCR檢測混合液36 μL，酶(Taq+UNG)0.4 μL，樣品4 μL。PCR循環(huán)參數：37 ℃×2 min，94 ℃×2 min，循環(huán)1次；再按93 ℃×10 s→62 ℃×40 s，循環(huán)40次；選用FAM(檢測T堿基)通道和HEX(或VIC/JOE)通道(檢測C堿基)，單點熒光檢測在62 ℃。TaqMan PCR反應在封閉的管中進行，擴增反應后，目的基因片段被標記呈不同的熒光，根據ABI7500熒光檢測儀對以上兩個通道的熒光Ct值結合說明書判斷基因型。基因型分為野生型(C/C)、雜合型(C/T)以及變異型 (T/T) 3種類型?；驕y序法： 參考NCBI中MTHFR基因片段(參考序列為NG_013351.1)設計擴增引物：上游引物為GGTCAGAAGCATATCAGTCATG；下游引物為AGCGAACTCAGCACTCCAC。將目的基因采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，產物片段大小為481 bp，基因擴增產物送上海華大基因公司進行測序，測序結果用BioEdit軟件分析并與MTHFR基因片段進行比對，比對結果與熒光定量PCR結果再進行比較。

1.3統(tǒng)計學方法所有數據分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行， Hardy-Weinberg平衡規(guī)律采用χ2檢驗，連續(xù)變量的組間比較采用獨立樣本t檢驗，病例組和對照組性別、基因型和等位基因頻率分布差異采用χ2檢驗。

2　結　　果

2.1癌癥組、冠心病組和健康對照組的人群特征癌癥組：男58例，女42例；平均58.0±12.6歲。冠心病組：男54例，女46例；平均62.0±15.2歲。健康對照組：男56例，女44例；平均58.0±13.1歲。癌癥組及冠心病組與健康對照組相比，年齡及性別分布無顯著性差異(P>0.05)。3組的MTHFRC677T基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(P>0.05)，樣本具有群體代表性。

2.2MTHFRC677T基因型測定結果經熒光定量PCR法和傳統(tǒng)測序法測定，所有樣本2種方法結果均一致：MTHFR基因C677T位點在浙江地區(qū)漢族人群中存在CC、CT和TT多態(tài)性。經PCR得到的產物送基因測序，DNAMAN分析測序結果，見圖1(a、b、c為隨機選取的樣本)。

注：a.野生型；b.雜合型；c.純合變異型

2.3MTHFR基因C677T多態(tài)性與消化系統(tǒng)癌癥、冠心病易感性分析結果詳見表1。

表1　癌癥組、冠心病組與對照組MTHFR基因型及基因型頻率的比較

注：1)與對照組比較χ2=2.640，P>0.05；2)與對照組比較χ2=0.330，P>0.05；3)與對照組比較χ2=0.403，P>0.05；4)與對照組比較χ2=1.390，P>0.05

癌癥組MTHFRC677T 基因型頻率分別為CC 34.00%、CT 46.00%、TT 20.00%，對照組分別為34.00%、54.00%和12.00%。純合變異型(TT)基因型頻率癌癥組略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。對照組的MTHFR677C和677T的等位基因頻率分別為61.00%和39.00%，癌癥組的MTHFR677C和677T的等位基因頻率分別為57.00%和43.00%，亦無顯著性差異(P>0.05)。

冠心病組MTHFRC677T基因型頻率分別為CC 32.00%、CT 53.00%、TT 15.00%，變異基因型(CT+TT)占68.00%，與對照組無顯著性差異。冠心病組的MTHFR677C和677T的等位基因頻率分別為58.50%和41.50%，對照組的MTHFR677C和677T的等位基因頻率分別為61.00%和39.00%，亦無顯著性差異(P>0.05)。

3　討　　論

國內外學者目前對MTHFR基因多態(tài)性與疾病易感性的研究結果不盡相同，可能與地域、種族、環(huán)境等外界因素相關，因此，進一步對不同地區(qū)的中國人群MTHFR基因多態(tài)性進行研究，能為中國人群基因多態(tài)性數據庫的建立提供相關數據。近年來，多項研究已表明MTHFR基因多態(tài)性與癌癥和腫瘤的易感性具有一定的相關性但結果不盡相同[12]。本研究主要選取了消化系統(tǒng)癌癥包括胃癌、結腸癌、直腸癌和食管癌共100例，與100例正常對照相比，未發(fā)現浙江地區(qū)人群MTHFRC677T基因多態(tài)性與上述癌癥的易感性呈顯著相關性。徐昌隆等[13]對浙江地區(qū)112例胃癌患者和218例正常對照MTHFRC677T及A1298C基因多態(tài)性分布進行了研究，發(fā)現MTHFRC677T的突變等位基因T及變異基因型(CT+TT)頻率在胃癌組和對照組之間均無顯著性差異，MTHFRA1298C突變等位基因C可能與胃癌的易感性有關。楊學習等[14]對江西地區(qū)的人群進行MTHFR基因C677T多態(tài)性與胃癌、大腸癌和肺癌易感性的關系中也未發(fā)現其相關性。Wang等[15]運用Meta分析從2 480例患者及3 228例對照中發(fā)現MTHFRC677T 基因多態(tài)性與中國北方人群的肺癌易感性相關，而未發(fā)現與中國南方人群肺癌易感性相關。因此，推測由于南北方地區(qū)差異性導致MTHFRC677T對各種癌癥或腫瘤易感性的差異。

越來越多的報道提示高同型半胱氨酸是心腦血管病發(fā)生的一個獨立危險因素[16]。已有研究結果顯示，攜帶MTHFR677TT基因型的個體血漿同型半胱氨酸的水平顯著高于其他基因型個體，其中MTHFR677TT基因型攜帶者中多數患心血管疾病的危險性也明顯增加[17]。本研究選取了100例冠心病患者，與對照組相比，未發(fā)現浙江地區(qū)人群中MTHFR基因多態(tài)性與冠心病的易感性有顯著相關性，可能與地區(qū)差異有關。吳兆蘇等[18]通過對17個省市人群的調查發(fā)現，冠心病發(fā)病率存在較大程度的地區(qū)差異，南方省市顯著低于北方。浙江屬于南方地區(qū)，因環(huán)境、氣候等多方面的影響，導致冠心病發(fā)病的危險因素可能存在差異。另外有些研究還發(fā)現MTHFRA1298C是心血管疾病的保護因子[19-20]。因此，同時對MTHFRC677T和A1298C的基因型檢測分型能更準確地反映MTHFR基因多態(tài)性對心血管疾病易感性的相關性。我們將在后續(xù)的研究中進一步探討MTHFRA1298C 位點的多態(tài)性在本地區(qū)人群中的分布及其與心血管疾病易感性的關系。

個體化醫(yī)療是未來醫(yī)學發(fā)展的方向，對基因多態(tài)性與疾病的易感性相關性及其機理進行深入研究，對于不同疾病的個體化治療具有重要意義。目前SNP的檢測平臺主要包括低通量的DNA測序法、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構想多態(tài)性、變性高壓液相色譜、高溫連接酶檢測反應技術和中低通量的TaqMan探針技術。我們采用了TaqMan 探針技術對MTHFR進行基因分型檢測，該方法原理是針對MTHFRC677T突變位點設計突變特異引物，通過核酸擴增、熒光標記探針及TaqMan MGB探針技術，雙通道檢測熒光Ct值，界定Ct值陰陽性范圍，由雙通道的陰陽性結果判斷MTHFR的基因分型。此法特異性更強，自動化程度也更高[21]。同時，我們采用傳統(tǒng)的基因測序法來進一步驗證突變位點，結果均一致。因此，此法具有可靠性、實驗結果穩(wěn)定、重復性好等特點，可用于對人群進行MTHFRC677T 基因分型及MTHFR基因多態(tài)性分析的研究及臨床應用。未來我們將加大病例數，進一步做深入探討。

[1]MEHLIG K， LEANDER K， DE FAIRE U， et al. The association between plasma homocysteine and coronary heart disease is modified by the MTHFR 677C>T polymorphism[J]. Heart， 2013， 99(23)： 1761-1765.

[2]STERN L L， MASON J B， SELHUB J， et al. Genomic DNA hypomethylation， a characteristic of most cancers， is present in peripheral leukocytes of individuals who are homozygous for the C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2000， 9(8)： 849-853.

[3]FRISO S， CHOI S W， GIRELLI D， et al. A common mutation in the 5，10-methylenetetrahydrofolate reductase gene affects genomic DNA methylation through an interaction with folate status[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2002， 99(8)： 5606-5611.

[4]高長明， 吳建中， 丁建華， 等. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與胃癌易感性的關系[J].中華流行病學雜志， 2002， 23(4)：289-292.

[5]ZHU N， GONG Y， HE J， et al. Influence of methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism on the risk of lung cancer and the clinical response to platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer： an updated meta-analysis[J]. Yonsei Med J， 2013， 54(6)： 1384-1393.

[6]ZHAO M， LI X， XING C， et al. Association of methylene-tetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphisms with colorectal cancer risk： a meta-analysis[J]. Biomedical Reports， 2013， 1(5)： 781-791.

[7]LARSSON S C， GIOVANNUCCI E， WOLK A. Folate intake， MTHFR polymorphisms， and risk of esophageal， gastric， and pancreatic cancer： a meta-analysis[J]. Gastroenterology， 2006， 131(4)： 1271-1283.

[8]LU Q， JIANG K， LI Q， et al. Polymorphisms in the MTHFR gene are associated with breast cancer risk and prognosis in a Chinese population[J]. Tumour Biol， 2015， 36(5)： 3757-3762.

[9]王芬芬，崔蓮花，宋揚.葉酸代謝相關酶基因多態(tài)性與消化系統(tǒng)腫瘤的關系[J].腫瘤，2010，30(12)：1074-1076.

[10]YANG B Y， LIU Y Y， LI Y F， et al. Geographical distribution of MTHFR C677T， A1298C and MTRR A66G gene polymorphisms in China： findings from 15357 adults of Han nationality[J]. PLoS One， 2013， 8(3)： e57917.

[11]XUAN C， LI H， ZHAO J X， et al. Association between MTHFR polymorphisms and congenital heart disease： a meta-analysis based on 9，329 cases and 15，076 controls[J]. Sci Rep， 2014， 4： 7311.

[12]XIE S Z， LIU Z Z， YU J H， et al. Association between the MTHFR C677T polymorphism and risk of cancer： evidence from 446 case-control studies[J]. Tumour Biol， 2015， 36(11)： 8953-8972.

[13]徐昌隆，王建嶂，鄭波，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T、A1298C多態(tài)性與胃癌的關系[J].溫州醫(yī)科大學學報，2015，45(5)：338-341.

[14]楊學習，李粉霞，易金萍，等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與胃癌、大腸癌和肺癌易感性的關系[J].廣東醫(yī)學，2010，31(18)：2375-2378.

[15]WANG X， YUE K， HAO L. Meta-analysis ofmethylenete-trahydrofolate reductase polymorphism and lung cancer risk in Chinese[J]. Int J Clin Exp Med， 2015， 8(1)： 1521-1525.

[16]KOSTULAS K， CRISBY M， HUANG W X， et al. A methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism in ischaemic stroke and in carotid artery stenosis[J]. Eur J Clin Invest， 1998， 28(4)： 285-289.[17]GOYETTE P， PAI A， MILOS R， et al. Gene structure of human and mousemethylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)[J]. Mamm Genome， 1998， 9(8)： 652-656.

[18]吳兆蘇，姚崇華，趙冬，等.我國多省市心血管病趨勢及決定因素人群監(jiān)測(中國MONICA方案)Ⅰ.發(fā)病率和死亡率監(jiān)測結果[J].中華心血管病雜志，1997，25(1)：6-11.

[19]HOBBS C A， JAMES S J， PARSIAN A， et al. Congenital heart defects and genetic variants in the methylenetetrahy-droflate reductase gene[J]. J Med Genet， 2006， 43(2)： 162-166.

[20]GOLDMUNTZ E， WOYCIECHOWSKI S， RENSTROM D， et al. Variants offolate metabolism genes and the risk of conotruncal cardiac defects[J]. Circ Cardiovasc Genet， 2008， 1(2)： 126-132.

[21]徐航，王琳，王毅，等.實時熒光定量PCR法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性方法的建立和應用[J].中國計劃生育學雜志，2004，12(5)：287-289.

Relationship betweenMTHFRC677T Polymorphisms and Susceptibility of Digestive System Cancer and Coronary Heart Disease

HUO Zhaoxia1， WU Yahong1， CHEN Jianzhong2， ZHU Qiaoyun1，LIANG Xingguang1， YANG Shenghua1， HUANG Mingzhu1

(1.Clinical Research Center， First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University， Hangzhou， Zhejiang 310003，China;2.Institute of Immunology， Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310058，China)

Objective:To investigate the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)C677T polymorphism and the susceptibility of digestive system cancer(DSC) and coronary heart disease(CHD) in Zhejiang Han nationality population. Methods: Blood samples from 100 DSC patients (DSC group)， 100 CHD patients(CHD group) and 100 healthy controls(control group) were collected for the extraction of genomic DNA. TaqMan real-time PCR and Sanger sequencing Genotyping were used to detectMTHFRC677T polymorphisms. Results: TheMTHFRC677T frequencies of CC， CT， and TT genotypes were 34%， 46% and 20% in DSC group， 32%， 53% and 15% in CHD group， and 34%， 54% and 12% in the control group， respectively. There were no significant differences inMTHFRC677T genotype and allele frequency between DSC or CHD patients and normal controls(P>0.05). Conclusion: No significant correlations are found betweenMTHFRC677T polymorphism and the susceptibility of DSC and CHD in Zhejiang Han nationality population.

methylenetetrahydrofolate reductase; C677T polymorphism; digestives system cancer; coronary heart disease

浙江省自然科學基金(LQ15H100001)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目(2015109130)

黃明珠，hmzjpharm@163.com

R735；R541.4

A

10.11851/j.issn.1673-1557.2016.05.004

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20160912.1018.002.html

2015-11-13)