史文靜葉麗珍周龍書

E-cad基因啟動子甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥中的異常表達(dá)*

史文靜①葉麗珍①周龍書①

目的：探討E-cad基因啟動子甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法：隨機(jī)選取于本院2013年1月-2015年1月行手術(shù)治療的異位內(nèi)膜病灶49例，其中45例術(shù)后病理診斷為子宮內(nèi)膜異位癥（卵巢）作為內(nèi)異癥組，對照組患者20例為同期住院因診斷性刮宮、行全宮切除術(shù)獲取的子宮內(nèi)膜組織。通過甲基化特異性PCR檢測兩組的E-cad啟動子甲基化，比較各分期間甲基化表達(dá)的差異。結(jié)果：內(nèi)異癥組異位內(nèi)膜中E-cad啟動子甲基化26例，甲基化率為57.8%，對照組中E-cad啟動子甲基化例數(shù)為0，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。內(nèi)異癥組中Ⅰ～Ⅱ期E-cad啟動子甲基化率為23.1%，Ⅲ期甲基化率為58.8%，Ⅳ期甲基化率為86.7%，內(nèi)異癥組不同分期甲基化率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：在子宮內(nèi)膜異位癥中存在E-cad基因啟動子甲基化表達(dá)，且隨分期進(jìn)展甲基化率升高，其可能在內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用。

E-鈣粘蛋白； 啟動子甲基化； 子宮內(nèi)膜異位癥

First-author's address：The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China.

子宮內(nèi)膜異位癥（內(nèi)異癥）所引起的痛經(jīng)、下腹痛、性交痛、和不孕等，嚴(yán)重影響著育齡婦女的健康、生活質(zhì)量和家庭穩(wěn)定，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，可達(dá)10%～15%，占普通婦科手術(shù)的30%以上［1-2］，從而日益受到人們的關(guān)注。筆者前期研究證實(shí)，作為重要的粘附分子的上皮型鈣粘蛋白（E-cad）表達(dá)的降低或喪失在內(nèi)異癥發(fā)病中起著一定的作用［3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，作為表觀遺傳學(xué)改變之一的DNA甲基化，其造成的相關(guān)基因異常表達(dá)在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中有著重要影響［4-6］。本研究采用甲基化特異性PCR（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）檢測E-cad基因啟動子區(qū)甲基化情況，并比較其在內(nèi)異癥不同臨床分期中的差異，探討E-cad基因啟動子甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究隨機(jī)抽取2013年1月-2015年1月于本院擬診卵巢巧克力囊腫患者行手術(shù)治療的異位內(nèi)膜病灶49例，其中45例術(shù)后病理診斷為子宮內(nèi)膜異位癥（卵巢）。按照美國生育學(xué)會（AFS）修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法，上述45例內(nèi)異癥組患者中13例為Ⅰ～Ⅱ期，17例為Ⅲ期，15例為Ⅳ期。對照組患者20例為同期住院因診斷性刮宮、行全宮切除術(shù)獲取的子宮內(nèi)膜組織，術(shù)后病理證實(shí)均為增殖期子宮內(nèi)膜。半年內(nèi)兩組患者均未接受激素、化療等藥物治療，無感染、腫瘤病史，無內(nèi)、外科其他疾病史，半年內(nèi)無妊娠及哺乳史，兩組的年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。組織標(biāo)本收集及研究方案已經(jīng)過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并與患者簽署知情同意書。

1.2方法 標(biāo)本以蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取新鮮組織標(biāo)本基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測0D260/OD280比值介于1.7～1.9。MSP方法檢測上述組織中E-cad啟動子甲基化狀態(tài)，如DNA序列CG中C未發(fā)生甲基化，經(jīng)亞硫酸鹽修飾后，則CG→UG，若已發(fā)生甲基化，則經(jīng)亞硫酸鹽修飾后CG→CG。DNA原始甲基化情況不同，經(jīng)處理后的DNA序列也有所不同。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn) （1）甲基化陽性：甲基化特異性引物（MP）擴(kuò)增出相應(yīng)長度片段，但非甲基化特異性引物（UMP）不能擴(kuò)增出相應(yīng)長度片段；甲基化陰性：MP未能擴(kuò)展出相應(yīng)長度片段，UMP能夠擴(kuò)增出相應(yīng)長度的片段；部分甲基化：UMP能夠擴(kuò)增出相應(yīng)長度的片段，MP也能擴(kuò)展出相應(yīng)長度的片段，則判斷部分細(xì)胞該基因啟動子區(qū)5'CpG島未甲基化。（2）MSP擴(kuò)增結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：如果甲基化特異性引物（M）擴(kuò)增出116 bpm條帶，非甲基化特異性引物（U）未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，標(biāo)示E-cad基因啟動子區(qū)CpG島存在完全甲基化，反之則不存在甲基化。如M、U均擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶，則標(biāo)示存在部分性甲基化（部分甲基化和完全甲基化在統(tǒng)計(jì)過程中均記為甲基化），見圖1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1E-cad基因啟動子甲基化在內(nèi)異癥組與對照組的表達(dá) 內(nèi)異癥組中甲基化率為57.8%（甲基化和部分甲基化都?xì)w于甲基化組），對照組中甲基化率為0，內(nèi)異癥組與對照組比較，E-cad基因甲基化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　兩組的E-cad啟動子甲基化率檢測結(jié)果比較

2.2內(nèi)異癥組中各期E-cad基因啟動子甲基化率的檢測 內(nèi)異癥組Ⅰ～Ⅱ期甲基化率為23.1%，Ⅲ期甲基化率為58.8%，Ⅳ期甲基化率為86.7%。Ⅲ～Ⅳ期甲基化率與Ⅰ～Ⅱ期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　內(nèi)異癥組中各期E-cad基因啟動子甲基化率的檢測結(jié)果比較

圖1　組織中E-cad甲基化檢測結(jié)果

3 討論

3.1E-cad基因啟動子甲基化在內(nèi)異癥患者中異位內(nèi)膜的異常表達(dá) 近年研究表明，腫瘤抑制基因的遺傳變異（SNP）和啟動子區(qū)甲基化可以使基因的表達(dá)改變或失活從而促進(jìn)腫瘤的形成和進(jìn)展［7-9］。其中DNA甲基化（DNA methylation）是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，對基因組DNA進(jìn)行可遺傳性修飾，而不影響DNA堿基序列。研究表明，DNA甲基化可導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性和DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。CPG島是存在于基因組的含有豐富CPG位點(diǎn)的某些區(qū)域。研究表明，CPG島為甲基化腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，且直接參與了細(xì)胞惡變過程［10-12］。國內(nèi)外研究表明，腫瘤細(xì)胞的粘附下降是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。近年來隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制的日益深入，發(fā)現(xiàn)在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中粘附分子起著關(guān)鍵性作用，且E-cad啟動子甲基化與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲之間存在著顯著相關(guān)［13-16］。子宮內(nèi)膜異位癥是一種具有腫瘤生物學(xué)行為的良性疾病，有侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)傾向，故推測斷，E-cad啟動子甲基化可能也與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［17-19］。

本研究中經(jīng)甲基化特異性PCR方法檢測的內(nèi)異癥組和對照組患者中E-cad基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)，顯示11例存在部分甲基化，也就是說既有甲基化特異引物的擴(kuò)增，也有非甲基化特異引物的擴(kuò)增。這一方面可能是由于混雜了炎性、正常或無CpG島異常甲基化的細(xì)胞在上述組織細(xì)胞中，從而顯示具有基因CpG島異常甲基化的細(xì)胞，另一種可能是上述細(xì)胞中兩個等位基因本身為半甲基化狀態(tài)。

也有學(xué)者認(rèn)為是由于部分組織可能有狀態(tài)不穩(wěn)定的表達(dá)水平較低的CpG島異常甲基化［11］，可能CpG島的甲基化是個漸進(jìn)化的過程，也就是說，每一個CpG島上存在的胞嘧啶堿基是逐漸被甲基化的。其他學(xué)者認(rèn)為只有CpG島甲基化率超過60%時才能夠完全關(guān)閉相應(yīng)的基因表達(dá)，而低比率的甲基化只能降低基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而不能關(guān)閉其表達(dá)。由此可見，無論E-cad基因啟動子CpG島是完全還是部分甲基化，CpG島的逐漸異常甲基化狀態(tài)可能會導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)逐漸減低，從而導(dǎo)致基因蛋白表達(dá)逐漸減少、甚至最后完全消失。亦有研究顯示基因轉(zhuǎn)錄抑制與CpG島基因甲基化直接相關(guān)，也就是說啟動子CpG島發(fā)生了甲基化，而使基因無法轉(zhuǎn)錄，從而抑制了基因的表達(dá)，其功能也隨之喪失［10］。

本試驗(yàn)中，45例內(nèi)異癥組中存在26例甲基化，甲基化率為57.8%；20例對照組中0例甲基化，甲基化率為0，內(nèi)異癥組中存在E-cad基因啟動子高度甲基化，而對照組織中未檢測到甲基化狀態(tài)。E-cad基因甲基化表達(dá)率內(nèi)異癥組明顯高于對照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此推測，E-cad基因啟動子區(qū)CpG島甲基化與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)，可能參與了內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展。這也和國外Nasu等［12］研究相一致。

3.2內(nèi)異癥組不同臨床分期E-cad基因啟動子甲基化率 有研究顯示，同一患者正常位置的子宮內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的E-cad mRNA轉(zhuǎn)錄水平是有差異的，異位內(nèi)膜水平較在位內(nèi)膜水平高［20-21］。E-cad在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜輕度下降，異位內(nèi)膜顯著下降，且與子宮內(nèi)膜異位癥臨床分期相關(guān)。Wu等［13］的研究也表明，隨著內(nèi)異癥病情的進(jìn)展，E-cad基因啟動子甲基化率有上升趨勢，其E-cad蛋白表達(dá)有下降趨勢。由此推測，E-cad基因啟動子CpG島的異常甲基化可能在內(nèi)異癥發(fā)病中起著重要作用。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥組中各期的E-cad啟動子甲基化率不同，Ⅰ～Ⅱ期甲基化率為23.1%，Ⅲ期甲基化率為58.8%，Ⅳ期甲基化率為86.7%。Ⅲ～Ⅳ期甲基化率與Ⅰ～Ⅱ期比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。臨床分期越晚，其甲基化率升高越明顯，這提示E-cad基因甲基化率與內(nèi)異癥的臨床分期有密切的關(guān)系，而E-cad甲基化水平可能對于預(yù)示內(nèi)異癥病情程度亦具有重要意義。

綜上所述，本研究顯示在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位病灶中存在著E-cad基因啟動子甲基化，且甲基化率隨臨床期別增加而增加，提示E-cad基因啟動子甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中可能起到一定的作用。今后應(yīng)在增大樣本量基礎(chǔ)上，深入研究同一個體異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的甲基化表達(dá)情況，有望進(jìn)一步探討甲基化酶抑制劑對異位病灶中E-cad基因啟動子可能的去甲基化作用，從而為阻遏異位病灶的增殖作用的研究提供新思路。

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The Expression of E-cad Promoter Region Methylation in Endometriosis

SHI Wen-jing，Y E Lizhen，ZHOU Long-shu.//Medical Innovation of China，2016，13（28）：011-014

Objective：To explore the expression of E-cad promoter region methylation in the occurrence and development of endometriosis.Method：49 cases of ectopic endometrial lesions were randomly selected in our hospital from January 2013 to January 2015 underwent surgery，including 45 cases of postoperative pathological diagnosis of endometriosis （ovarian） as the endometriosis group.20 patients hospitalized for diagnostic curettage，endometrial tissue obtained by hysterectomy as the control group.The methylation of E-cad promoter was detected by methylation specific PCR in two groups，and the differences of methylation expression were compared in different periods.Result：26 cases（57.8%） in the endometriosis group had E-cad promoter region methylation，but no case in the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.In endometriosis group the Ⅰ-Ⅱstage E-cad promoter methylation rate was 23.1%，Ⅲ stage methylation rate was 58.8%，Ⅳ stage methylation rate was 86.7%，in different stages of methyl rate the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：E-cad promoter region methylation may play an important role in the occurrence and development of endometriosis.

E-cadherin； Promoter methylation； Endometriosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.28.003

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B060300033）

①廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣東 廣州 510260

史文靜

（2016-06-01） （本文編輯：周亞杰）