聶湘輝 劉麗華 胡蒞鴻

ChiTaSBSS1200血液核酸檢測系統(tǒng)的分析性能驗證

聶湘輝 劉麗華 胡蒞鴻

廣東省河源市中心血站（河源513000）

目的 對ChiTaSBSS1200血液核酸檢測系統(tǒng)（簡稱“ChiTaS”）主要分析性能進行驗證，確定該系統(tǒng)是否穩(wěn)定、準確、可靠。方法 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）相關文件要求，對在ChiTaS上開展的HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA項目進行檢出限、精密度、準確度及抗干擾等方面驗證。結果 ChiTaS分析系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA最低檢出限分別為3.63（3.16～6.26）IU/mL、12.71（10.37～21.63）U/mL、25.49（21.43～37.48）IU/mL；HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA陽性樣本總變異系數(shù)分別為2.56%、1.03%、3.36%；22個陰性樣本和10個陽性樣本進行8混樣模式檢測結果為反應性，拆分檢測結果：陽性樣本符合率100%、陰性樣本符合率100%；溶血血漿（血紅蛋白含量為5 g/L）、脂肪血漿（甘油三酯大于6.3 mmol/L）對低濃度HBV（6.3 IU/mL）、HCV（23.3 IU/mL）、HIV（47.6 IU/mL）樣本檢出無顯著影響。結論 ChiTaS檢出限、精密度、準確度等均達到生產(chǎn)商的檢測性能的要求，實驗室該系統(tǒng)的檢測能力可以滿足本血站對無償獻血者樣本的常規(guī)核酸檢測要求。

核酸檢測 性能驗證

檢測系統(tǒng)的分析性能評價是臨床檢驗質(zhì)量管理的重要內(nèi)容之一?！堆炯夹g操作規(guī)程（2015版）》要求所有血液在進行血清學檢測的基礎上，必須進行核酸檢測。隨著血液核酸檢測全覆蓋工作的推進，如何對血液核酸檢測的新設備進行性能驗證、有效進行過程監(jiān)控是很多血站檢驗科面臨的難題。目前核酸檢測系統(tǒng)的操作性能和分析性能信息大部分由生產(chǎn)廠家提供，這些參數(shù)源自廠家在最佳條件下完成，因此實驗室應對各自實驗室檢測系統(tǒng)重新評價或建立性能參數(shù)，才能保證檢測結果符合臨床應用需求［1］。CAP認可和ISO15189要求對于定量檢測性能驗證均有詳細說明，對于免疫學定性檢測性能驗證指標尚無明確的行業(yè)標準。國內(nèi)專家認為在定性檢測中最重要的性能驗證應包括檢測的精密度、準確性及最低檢出限［2］。本研究參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）相關文件要求，從檢出限、精密度、準確度率等方面對ChiTaS檢測系統(tǒng)進行性能驗證：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 選擇本血站2015年1月1日—2016年1月1日采集的無償獻血者血漿。收集的所有樣本均嚴格按照本科室現(xiàn)行SOP要求檢測［3］。①陰性樣本：實驗室檢測HBVsAg、HBVsAb、HBVeAg、HBVeAb、HBVcAb、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV、HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢測結果均為陰性；②HBV陽性樣本：HBVsAg、HBVeAg/ HBVeAb、HBVcAb、HBV-DNA結果均為陽性；③HCV陽性樣本：稀釋后的HCV陽性質(zhì)控品；④HIV陽性樣本：抗-HCV雙試劑陽性且確認試驗結果陽性；⑤溶血血漿（血紅蛋白含量為5 g/L）及脂肪血漿（甘油三酯大于6.3 mmol/L）由本實驗室制備，HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA檢測結果均為陰性。

1.1.2 主要儀器 ChiTaS BSS1200自動核酸純化儀；ABI 7500核酸擴增儀；HR40-IIA2生物安全柜；DL-5M低速冷凍離心機。

1.1.3 主要試劑 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）由上海浩源生物科技有限公司提供，批號為MF20160102。質(zhì)控品由北京康徹思坦生物技術有限公司提供，HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA濃度分別為500 IU/mL、2000 IU/mL、2000 IU/mL，批號為201601001。

1.2 方法

1.2.1 檢出限驗證 將HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA定值質(zhì)控品用陰性血漿進行梯度稀釋，HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA系列濃度為：①12.6 IU/mL、46.6 IU/ mL、95.2 IU/mL；②6.3 IU/mL、23.3 IU/mL、47.6 IU/ mL；③3.2 IU/mL、11.7 IU/mL、23.8 IU/mL；④1.5 IU/ mL、5.8 IU/mL、11.9 IU/mL。采用單人份檢測模式（簡稱“單檢”），每個濃度重復10次，統(tǒng)計分析其95%檢出限及置信區(qū)間。

1.2.2 準確度驗證 22例陰性樣本與HBV（6例）、HCV（2例）、HIV（2例）陽性樣本交替間隔排列。先采用混合樣本檢測模式（簡稱“混檢”），呈反應性結果再進行單檢拆分。

1.2.3 精密度驗證 分別將HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA質(zhì)控品稀釋至100%檢出限（由廠家提供），即稀釋后HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA質(zhì)控品終濃度分別為18.9 IU/mL、69.9 IU/mL、142.8 IU/mL。對該樣采用單檢模式檢測，連續(xù)檢測5天，每日重復檢測4次，陽性結果以Ct值表示，參照文獻［4］計算Ct值的標準差和變異系數(shù)（CV值），同廠家提供的允許CV值比較。

1.2.4 抗干擾確認 將HBV、HCV、HIV質(zhì)控品按一定比例分別加入到溶血血漿、重度脂肪血漿（乳糜狀）及陰性血漿中，使HBV、HCV、HIV質(zhì)控品在血漿中終濃度分別為：6.3 IU/mL、23.3 IU/mL、47.6 IU/mL。與陰性樣本混檢模式檢測20次。

1.2.5 質(zhì)控檢測 每次實驗過程中同時檢測試劑盒配套的陰性、陽性對照以及外部購買的陽性質(zhì)控（濃度為廠家提供的100%檢出限）。當每次質(zhì)控結果在控且符合實驗室SOP要求時，實驗數(shù)據(jù)為有效，否則要求重新檢測。

1.2.6 統(tǒng)計方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件PROBIT統(tǒng)計分析系統(tǒng)的95%檢出限及其相關置信區(qū)間。準確性和精密度分別用陰性、陽性檢出率、Ct值的標準差及變異系數(shù)進行驗證。

2 結 果

2.1 檢出限驗證結果 HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA95%檢出限分別為3.63 IU/mL、12.71 U/mL、25.49 IU/mL，均低于廠家提供的檢出限。見表1。

表1 ChiTaS系統(tǒng)檢測HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢出限驗證結果

2.2 準確度驗證結果 22個陰性樣本和10個陽性樣本進行8混樣模式檢測結果為反應性，拆分單檢結果中22個陰性，陰性符合率100%；10個陽性樣本結果分別為HBVDNA 6例、HCV-RNA 2例、HIV-RNA 2例，陽性符合率為100%。

2.3 精密度驗證結果 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA結果均為陽性，Ct值的均數(shù)分別為37.93、33.63、40.60，總變異系數(shù)分別為2.56%、1.03%、3.36%。均低于廠家要求允許的CV值（10%）。

表2 ChiTaS系統(tǒng)檢測HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA精密度驗證結果

2.4 抗干擾能力驗證 含有低濃度HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA質(zhì)控品的溶血血漿（血紅蛋白含量為5 g/ L）、重度脂肪血漿（甘油三酯大于6.3 mmol/L）及正常陰性血漿檢測結果見表3：在溶血血漿及重度脂肪血漿中HIV-RNA的檢出率較低，分別為90%（18/20）和95%（19/20），與正常陰性血漿檢出率（95%）比較，差異無統(tǒng)計學意義，P=0.147；=1.026，P=0.311）；在溶血血漿、重度脂肪血漿及正常陰性血漿中HBV-DNA、HCV-RNA檢出率均為100%（20/20）。溶血血漿及重度脂肪血漿對低濃度的HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢出均無影響。

表3 ChiTaS系統(tǒng)對溶血血漿和重度脂肪血漿干擾能力驗證結果

3 討 論

血站實驗室實行有效的質(zhì)量控制，對于相關輸血傳染病檢出、保障輸血安全至關重要［5］。實驗室應盡量選擇特異性、靈敏性高及穩(wěn)定性好的檢測系統(tǒng)。目前國內(nèi)血站實驗室檢測均采用國家法規(guī)規(guī)定的血液檢測方法，基本上實現(xiàn)自動化檢測設備和商品化試劑盒。葛紅衛(wèi)［6］等提出為獲得準確、穩(wěn)定檢測結果，實驗室除在血液檢測方法使用之前對檢測系統(tǒng)進行確認外，還應在使用一定時間周期內(nèi)，對已經(jīng)過確認的檢測方法的進行性能驗證，識別使用過程中產(chǎn)生的偏差，并及時加以糾正。ChiTas可以采取混檢或單檢模式HBV-DNA/HCV-RNA/HIV-RNA單管同時檢測，直接報告反應性病原體種類，不需要再進行鑒別檢驗。本研究采用購買的定值血漿質(zhì)控品，每個項目均收集40例檢測結果做檢出限驗證分析，結果顯示該系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢出限分別為3.63（3.16～6.26）IU/mL、12.71（10.37～21.63）U/mL、25.49（21.43～37.48），符合FDA對NAT血液篩查HBV（100 IU/mL）、HCV（100 copies/mL）、HIV（100 copies/mL）分析靈敏度要求［7］，均低于廠家提供的檢出限，符合實驗室核酸檢測要求。曹誼［8］等認為研究結果與廠家參數(shù)比較不完全一致，其原因可能是由于廠家進行性能驗證時使用的是國際標準品和大樣本檢測。

對于定性試驗，準確度通常采用陰性、陽性符合率來驗證［9］。本研究采用混檢、單檢模式確認陰性、陽性符合率，結果顯示：混檢陽性符合率、單檢拆分陽性率符合率為100%。在拆分單檢時，相間排列在陽性樣本間22個陰性樣本結果均為陰性，陰性符合率100%，未出現(xiàn)假陽性。由于本實驗室實行剔除酶免結果陽性樣本再進行核酸檢測策略，樣本陽性率低，且在整個性能驗證過程中未出現(xiàn)樣本間交叉污染現(xiàn)象，故本研究未對該儀器抗交叉污染性能進行驗證。

精密度作為性能驗證的重要指標之一，定量檢測通常以變異系數(shù)或標準差表示。定性檢測的精密度驗證可以根據(jù)檢測樣本的S/C0值，按照定量檢測方式進行CV值的分析。本研究中，由于ABI7500核酸擴增儀結果無法導出S/ C0值，則采用Ct值計算CV值。結果顯示：HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA總變異系數(shù)分別為2.56%、1.03%、

3.36 %，均低于廠家低于測定的CV值（10%），說明Chi-TaS系統(tǒng)在本實驗室具有良好的精密度，符合實驗要求。同時，ChiTaS系統(tǒng)抗干擾能力強，低濃度陽性樣本不受樣本中脂肪血漿（甘油三酯）、溶血血漿（血紅蛋白）的影響。

綜上所述：ChiTaS檢出限、精密度、準確度等參數(shù)符合要求，實驗室該系統(tǒng)的檢測能力可以滿足本血站對樣本的常規(guī)核酸檢測要求。

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10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.022

2016-03-25）