● 許朋 鄭春輝 項(xiàng)煒 劉吉珺 余蘭 馮昆

新生雞蛋中卵清蛋白、卵黃蛋白的提取、分離及電泳分析

● 許朋1鄭春輝2項(xiàng)煒2劉吉珺2余蘭1馮昆2

本實(shí)驗(yàn)采用RIPA裂解法裂解雞新生蛋、雞普通蛋中的卵黃蛋白和卵清蛋白，然后采用BCA法對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行蛋白定量，測(cè)定相同條件下的卵黃蛋白、卵清蛋白（總蛋白）表達(dá)量的差異。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分析上述卵黃蛋白和卵清蛋白的表達(dá)豐度，從蛋白水平評(píng)價(jià)雞新生蛋、雞普通蛋營(yíng)養(yǎng)價(jià)值之差異，為生活中科學(xué)的選擇雞蛋提供參考價(jià)值和理論依據(jù)。

卵清蛋白；卵黃蛋白；蛋白種類

隨著人們生活水平的不斷提高，人們對(duì)直接自己生活的質(zhì)量要求越來越高，而雞蛋中含有好多我們平時(shí)所需要的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分，我們平時(shí)一般每天早上都吃雞蛋補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。我們所需的主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來自于卵清、卵黃蛋白[1]。新生雞蛋與普通雞蛋相比，其中富含的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分并非完全相同，而新生雞蛋與普通雞蛋的卵清、卵黃蛋白的組成成分和含量也會(huì)存在一些差異。而這二者雞蛋中的卵黃和卵清蛋白的組分差異是什么、以及蛋白的含量差異是多少。蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分在新生雞蛋與普通雞蛋之間的差距具體又有多少。此項(xiàng)研究為雞蛋的儲(chǔ)存時(shí)間中卵清、卵黃蛋白的營(yíng)養(yǎng)成分和含量差異提供了一組數(shù)據(jù)。

1 材料和設(shè)備

1.1 材料

雞新生蛋（市場(chǎng)購買）、雞普通蛋 （ 市場(chǎng)購買）、15ml離心管、EP 管、Premixed Protein Maker（Takara）、4×Protein SDS-PAGE Loading Buffer（Takara）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、濾紙、甘氨酸、Tris，（除上述特別說明外，其他試劑均購于天津大茂試劑廠，均為分析純。）

1.2 儀器

搖床 （上海善志儀器設(shè)備有限公司 ）、移液器(Eppendorf）、離心機(jī)（安徽中科中佳有限公司）、TS-2000A脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、PowerPac（Bio-RAD）、酶標(biāo)儀（Therm）、全自動(dòng)凝膠分體系統(tǒng)（Biu-Rad）、細(xì)胞培養(yǎng)孔板(NEST Biotechnology Co.LTD)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品提取

將分離后的卵清蛋白和卵黃蛋白各取1ml都加入RIPA裂解液（RIPA裂解液中含有50mmol/L PH7.4的Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1%NP40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，以及蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）4ml[2]，在冰浴條件下充分混勻上述兩支試管，靜置30min后，在4℃條件下12000rpm高速離心棄沉淀留上清，即得制備好的蛋白樣品原液。制備好的蛋白樣品原液，在﹣20℃條件下保存。

2.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備

2.2.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液的配置

稱取20mg牛血清白蛋白（BSA）于一潔凈試管中[3]，向上述試管中加入0.8ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液[4]，充分震蕩、混勻、溶解至溶液澄清透明，即可配制成25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液。

2.2.2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置

取20μl 25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液，加入980μl稀釋液，混合均勻后，既得濃度為0.5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 BCA工作液的配制

根據(jù)樣品數(shù)量，按50∶1（體積為50的BCA試劑A與體積為1的BCA試劑B）來配制適量BCA工作液，并充分混勻。在5mlBCA試劑A加100μl BCA試劑B，混勻，配制成5.1ml BCA工作液。新配置的BCA工作液應(yīng)該在24小時(shí)內(nèi)完成測(cè)定。

2.4 蛋白濃度檢測(cè)

A.取96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔，并將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μl，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

B.將不同濃度的適量體積的樣品加入96孔板的樣品孔。

C.各孔加入200μl BCA工作液，在37℃中孵育30min。在相同條件時(shí)間下觀察樣品顏色的變化，然后進(jìn)行吸光度測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度-OD值圖像，既是蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，在繪制完成后進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性在0.99以上，相關(guān)性良好，可以作為定量依據(jù)。

D.用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品及標(biāo)準(zhǔn)品A562。

E.計(jì)算樣品的蛋白濃度：將稀釋相同倍數(shù)的蛋白樣品平行進(jìn)行3次吸光度的測(cè)定取其均值后將相應(yīng)的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得蛋白測(cè)定液濃度，再乘以稀釋倍數(shù)既得蛋白測(cè)定原樣品濃度。

2.5 電泳 (Electrophoresis)

取上述制備好得蛋白樣品原液適當(dāng)稀釋后與4×Protein SDS-PAGE Loading Buffer 按照3：1的比例混合，震蕩均勻，于100℃沸水中水浴加熱5min，蛋白變性，變性后的蛋白樣品等體積上樣，每孔上樣10微升，卵黃、卵清蛋白各做三個(gè)重復(fù)，其中，Maker 上樣量為5微升，各孔樣品上樣完畢后準(zhǔn)備電泳。濃縮膠電泳電壓為80V，經(jīng)過約15分鐘后當(dāng)樣品由濃縮膠進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)染料至底部電泳結(jié)束。在跑電泳過程中保證內(nèi)液保持在正常水位，電泳結(jié)束后小心取出凝膠，用蒸餾水清洗3次后用染色液染色2小時(shí)（30r/min），然后再用蒸餾水洗滌3次，最后用脫色液在搖床脫色一個(gè)晚上，待條帶清晰透明，放置于成像系統(tǒng)上進(jìn)行照片采集并保存[5]。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

3.1.1 蛋白的定量分析

用BCA法測(cè)定好蛋白質(zhì)的含量[9]，可以清晰地觀察到溶液顏色變化的深淺，且顏色的變化與蛋白質(zhì)的含量是成正比的[10]。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白質(zhì)含量(mg/ml)為橫坐標(biāo)，A(吸光度)為縱坐標(biāo)。同時(shí)還可以根據(jù)吸光值的大小求出待測(cè)蛋白溶液中蛋白質(zhì)的含量。

3.1.2 電泳分析

觀察電泳結(jié)果，通過蛋白質(zhì)條帶的變化來分析蛋白質(zhì)的大小，可以清晰地看出卵黃蛋白和卵清蛋白中蛋白種類的多少以及蛋白質(zhì)分子量的峰值。通過與Marker標(biāo)準(zhǔn)條帶的對(duì)照，可以推測(cè)出卵黃蛋白和卵清蛋白中蛋白質(zhì)的分子量。

3.2 討論

觀察電泳條帶，可以清楚地看到卵黃蛋白種類多于卵清蛋白種類，且卵黃蛋白和卵清蛋白中蛋白質(zhì)的分子量主要集中在35kD-117kD ，卵黃蛋白的峰值出現(xiàn)在117kD，而卵清蛋白的峰值出現(xiàn)在35kD-49kD。卵黃蛋白在35kD-120kD主要集中有9種蛋白質(zhì)，卵清蛋白在19kD，35-117kD主要集中有4種蛋白質(zhì)。

（作者單位：1遵義醫(yī)學(xué)院；2遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)）

[1]劉建.雞蛋與健康[J].衛(wèi)生與健康,2011,8(3):14.

[2]王登川,鄭惠玲,劉新光.種組蛋白提取方法的比較,廣東醫(yī)學(xué)院報(bào),2015,333(5):538-541.

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[5]Zastrozhin MS,Brodyansky VM,Skryabin VY,Grishina EA,Ivashcheko DV,Savchenko LM,Kibitov AO,Bryun EA,Sychev DA,2017,Pharmacodynamic genetic polymorphisms affect adverse drug reactions of haloperidol in patients with alcohol-use disorder,Pharmacogenomics and personalized medicine,10:209-215

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[10]陳曉梅,劉雅文,程熠,孫靜,李勇,王韶.考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性觀察[J].中國公共衛(wèi)生,2006，22(3):380-381.

Extraction, separation and electrophoresis analysis of egg albumin and yolk protein in newborn eggs

Xu P.1Zheng C.H.2Xiang W.2Liu J.J.2Yu L.1Feng K.2

in this experiment by using RIPA cracking cracking chicken eggs, in the ordinary chicken egg yolk protein and the new ovalbumin, then using the BCA method for protein extraction of proteins by quantitative, determination of the same conditions of yolk protein, egg albumin (total) protein expression differences.Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method to analysis the yolk protein and the expression of ovalbumin abundance, from chicken new eggs, chicken protein level evaluation difference of ordinary eggs nutrition value, provide reference for the choice of the eggs of the life science value and theoretical basis.

ovalbumin ; The yolk protein; Types of protein