蔡偉祥，方建鳳，莊偉，李玉梅

（武警浙江總隊嘉興醫(yī)院　消化內(nèi)科，浙江　嘉興　324000）

·論著·

分離、鑒定與培養(yǎng)大鼠肝細胞、肝星狀細胞和Kupffer細胞

蔡偉祥，方建鳳，莊偉，李玉梅

（武警浙江總隊嘉興醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江嘉興324000）

目的：建立穩(wěn)定的同時分離原代大鼠肝細胞（HC）、肝星狀細胞（HSC）和Kupffer細胞（KC）的方法，并初步評估其在體外培養(yǎng)的特征。方法：通過膠原酶原位灌注獲得肝臟單細胞懸液，隨后行等密度離心結(jié)合選擇性貼壁純化肝臟原代細胞，細胞的產(chǎn)量和活力經(jīng)自動細胞計數(shù)儀計算出，純度經(jīng)免疫熒光、特殊染色及吞噬等實驗進行鑒定。結(jié)果：大鼠原代HC產(chǎn)量為（21.0±8.2）×106/g肝組織，活力為92.1%±2.1%，純度為96.5%±2.2%；原代HSC產(chǎn)量為（2.5±0.8）×106/g肝組織，活力為90.1%±3.8%，純度為93.1%±1.5%；原代KC產(chǎn)量為（4.1±1.2）×106/g肝組織，活力為96.2%±2.7%，純度為95.1%±1.4%。分離的HC、HSC和KC適合體外長期培養(yǎng)。HSC在體外培養(yǎng)過程中失去維生素A，逐漸向成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變。KC在體外可增殖，至14 d時仍表達CD68，具有較強的吞噬能力。結(jié)論：成功建立同時分離和培養(yǎng)大鼠HC、HSC和KC的方法，為進一步研究肝臟病理生理提供細胞基礎。

細胞分離；肝細胞；肝星狀細胞；Kupffer細胞

肝臟是人體最大的消化腺，由肝細胞（hepatocyte，HC）和多種不同種類的非實質(zhì)細胞（nonparenchymal cells，NPCs）組成［1］。HC大約占肝臟細胞總數(shù)的60%，而NPCs大約占總數(shù)的40%［2］。NPCs主要由肝竇內(nèi)皮細胞（sinusoidal endothelial cells，SEC）、Kupffer細胞（Kupffer cells，KC）和肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）構(gòu)成，分別占19%、15%和6%［2-3］。肝臟不僅是機體的代謝中心，而且在機體防御、控制激素水平、儲存血液、調(diào)節(jié)血pH值、免疫調(diào)節(jié)等中發(fā)揮重要作用。HC構(gòu)成肝臟的主體，是行使上述功能的主要細胞，也是多種肝損傷因素的主要靶點，其損傷將導致急慢性肝病。然而，多種肝臟病理生理，如藥物性肝損害、脂肪肝、肝炎、肝纖維化和肝硬化，當最初的損傷因素作用于HC后，NPCs可能會繼發(fā)地顯著惡化最初的損傷［4-5］。因此，獲取足夠量的高活力和高純度肝臟多種細胞是深入研究肝內(nèi)細胞功能、信號轉(zhuǎn)導、生理及病理過程的重要前提。目前已有HC和HSC的細胞系，但細胞系的一些生物學特性與原代細胞明顯不同［6］。此外，目前關(guān)于同時分離肝臟多種細胞的報道不多。我們結(jié)合前期研究，采用膠原酶、等密度離心與選擇性貼壁分離HC、HSC和KC，并對分離和培養(yǎng)后的一些特性進行鑒定。這種方法可以有效地分離肝臟HC、HSC和KC，為進一步研究肝臟生理和病理提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與材料 雄性SD大鼠5只，購于上海交通大學醫(yī)學院動物中心（JD201500123-1041），清潔級飼養(yǎng)至12周左右，體質(zhì)量400～450 g用于實驗。實驗前12 h禁食，可自由飲水。

Nycodenz購于axis-shield公司；DMEM、Williams’ E、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、glutamine、penicillin-streptomycin、IV型膠原酶、自動細胞計數(shù)儀購于Invitrogen公司；糖原染色、油紅O染色試劑盒購于南京建成生物研究所；細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK-18）、神經(jīng)膠質(zhì)酸蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、CD68、α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、Alexa Fluor 594驢抗小鼠二抗、Alexa Fluor 488羊抗兔二抗購于Abcam公司；聚苯乙烯微珠購于Sigma公司。

1.2 肝臟細胞分離

1.2.1 灌注懸浮液、等密度離心液與細胞培養(yǎng)液的配制：所有灌注液均行無菌過濾，實驗前在39 ℃水浴箱中復溫。灌注懸浮液的配方見表1，配方粉末購于上海生物工程有限公司。

Nycodenz用于配制等密度離心液。稱取30 g Nycodenz粉末，加入80 mL GBSS/A液，磁力攪拌器加熱溶解后，定容至100 mL，調(diào)pH值至7.4，配成30% Nycodenz儲存液。

HC培養(yǎng)液為Williams’E+10% FBS+100 nmol/L dexamethasone+2 mmol/L glutamine+100 U/mL penicillin-streptomycin；HSC與KC培養(yǎng)液為DMEM+ 10% FBS+2 mmol/L glutamine+100 U/mL penicillinstreptomycin。

1.2.2 肝臟單細胞懸液獲?。何彀捅韧祝? mg/100 g）腹腔注射麻醉大鼠。大鼠頭部以下部位浸泡75%酒精30 s，以保持相對無菌。行腹部正中切口，充分暴露肝臟。大鼠胃腸組織撥向腹腔左側(cè)，于22G留置針門靜脈穿刺后固定。灌注預熱的EGTA液10 min（速率為15 mL/min）后，灌注含0.5 mg/mL IV型膠原酶的灌注液15 min，速率為15 mL/min。切斷肝臟與周圍組織的聯(lián)系，剔除血管、筋膜，在10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)剪碎，倒入三角燒瓶內(nèi)，加入含0.5 mg/mL膠原酶的酶消化液50 mL，于37 ℃中振蕩消化30 min。取出消化液，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)濾過，以下操作在4 ℃下進行，除非特別說明。

表1 肝細胞灌注懸浮液配方（mg/L）

1.2.3 HC純化與培養(yǎng)：將所過濾的消化液平均分到4個50 mL離心管中，每管補GBSS/B至40 mL。以50×g離心2 min，懸液移至另外無菌離心管中用于HSC和KC分離。收集細胞沉淀于一新的50 mL離心管，GBSS/B液懸浮，再行50×g離心2 min，取細胞沉淀。上述離心過程再重復2次，以去除死細胞和細胞碎片。取細胞沉淀懸浮于HC培養(yǎng)液中，調(diào)細胞計數(shù)為5×105/mL，種植于膠原包被的6孔板中。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，首次換液，以后每2 d換液1次。

1.2.4 HSC純化與培養(yǎng)：將收集的HSC和KC懸液，于4 ℃，500×g離心7 min后，棄上清，留取細胞沉淀。合并沉淀物于50 mL無菌離心管內(nèi)，再次離心，取細胞沉淀，加入8.2%的Nycodenz混勻（用30% Nycodenz儲存液與GBSS/A配制），上覆少許GBSS/B，行密度梯度離心（1 500×g離心17 min）。離心結(jié)束后取界面處細胞，用GBSS/B離心清洗2次（500×g離心7 min）。取細胞沉淀懸浮于HSC培養(yǎng)液中，調(diào)細胞計數(shù)為5×105/mL，24 h后首次換液，以后每48 h換液1次。

1.2.5 KC分離與純化：梯度離心取出界面處細胞后，其余部分加入等體積的GBSS/B液，混勻，用GBSS/B離心清洗2次（500×g離心7 min）。無血清DMEM懸浮細胞沉淀，調(diào)細胞計數(shù)為1×106/mL，種植于10 cm培養(yǎng)皿中，細胞培養(yǎng)箱孵育。30 min后，吸出DMEM，GBSS/B液輕柔洗3次，去除未貼壁細胞，此時更換為KC培養(yǎng)基。以后每48 h換液1次。細胞換液及培養(yǎng)的一般操作遵循規(guī)范化的標準［7］。

1.3 細胞產(chǎn)量與活力 應用自動細胞計數(shù)儀計算細胞量與活力。100 μL細胞懸液與等量0.4%臺盼藍（V/V）混合，取10 μL混合液加入細胞計數(shù)板，將計數(shù)板插入到計數(shù)儀卡槽內(nèi)，按“細胞計數(shù)”將自動得到細胞的總量、活細胞數(shù)、死細胞數(shù)和細胞活力。

1.4 特殊染色

1.4.1 糖原染色：糖原染色用于鑒定HC與NPCs內(nèi)糖原顆粒。新分離與培養(yǎng)7 d或14 d的HC、HSC、KC種植于圓形無菌載玻片上。貼壁后95%酒精固定15 min，蒸餾水洗1 min，自然晾干。滴加過碘酸酒精染液室溫避光孵育10 min，流水沖洗5 min；滴加Schiff氏液覆蓋玻片，室溫孵育15 min，流水沖洗1 min，自然晾干。滴加蘇木精染核30 s，流水沖洗5 min，中性樹膠封片。

1.4.2 油紅O染色：油紅O染色用于鑒定HC與NPCs細胞內(nèi)是否含有脂滴。細胞貼壁后4%多聚甲醛固定15 min，純水洗3次，加入新鮮配制的油紅O工作液（3份儲存液+2份純水）作用15 min后，純水洗5次，隨后，蘇木素復染30 s，水溶性封片劑封片鏡檢。

1.5 自發(fā)熒光 維生素A可自發(fā)藍綠色熒光。HSC儲有維生素A，因此，采用熒光顯微鏡在328 nm波長下觀察HSC。

1.6 免疫熒光 為評估細胞的表型，新分離和培養(yǎng)7 d或14 d的HC、HSC和KC種植在圓形無菌載玻片上。PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定20 min后，PBS洗3次，0.5% trixon X-100通透5 min，PBS洗3次，孵育5% BSA 1 h阻止非特異性染色。隨后，4 ℃孵育一抗CK-18（1∶100稀釋，PC標志）、GFAP（1∶200，靜止HSC標志）、CD68（1∶200，KC標志）、α-SMA（1∶200，活化HSC標志）24 h。PBS洗后，加入Alexa Fluor 594驢抗小鼠二抗或Alexa Fluor 488羊抗兔二抗37℃孵育30 min。再用PBS洗3次，DAPI染核3 min，PBS清洗1次，熒光抗淬滅劑封片，激光共聚焦下拍照。隨機選擇10個視野計算染色陽性的細胞和總的藍色細胞核數(shù)，重復3次。

1.7 吞噬聚苯乙烯微珠 KC具有吞噬外來異物的功能。激發(fā)波長為470熒光標記的聚苯乙烯微珠與培養(yǎng)基1∶250混合與新分離和培養(yǎng)的HC和NPCs孵育60 min，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，DAPI染色3 min，熒光抗淬滅劑封片，激光共聚焦成像。

2 結(jié)果

2.1 HC分離、培養(yǎng)和鑒定 HC因密度和體積明顯高于NPCs，低速離心（50×g）2 min可使大部分HC與NPCs分離［2］。經(jīng)Countess自動細胞計數(shù)儀得出平均HC產(chǎn)量為（21.0±8.2）×106/g肝組織，活力為92.1%±2.1%，見表2。新分離的HC多為圓形或卵圓形，細胞核染色質(zhì)明顯，胞核突出，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)7 d的HC逐漸失去立方型結(jié)構(gòu)，形態(tài)類似扁平的成纖維細胞。糖原染色顯示新分離的HC胞漿含有大量的紅色顆粒。隨機選擇10個視野計算CK-18染色陽性的細胞和總的藍色細胞核數(shù)，并獨立重復3次，顯示染色陽性細胞96.5%±2.2%。培養(yǎng)7 d時，HC失去上皮表型，開始退化或向成纖維化表型轉(zhuǎn)變，但胞漿仍含有大量的紅色糖原顆粒，CK-18表達仍為陽性。見圖1。

表2 分離的單個肝臟細胞的量、活力與純度（±s）

表2 分離的單個肝臟細胞的量、活力與純度（±s）

細胞類型量（×106/g肝組織）活力（%）純度（%）HC21.0±8.292.1±2.196.5±2.2 HSC 2.5±0.890.1±3.893.1±1.5 KC 4.1±1.296.2±2.795.1±1.4

2.2 HSC分離、培養(yǎng)和鑒定 HSC因胞質(zhì)內(nèi)含有大量維生素A，又稱儲脂細胞，其密度在所有肝臟細胞中最輕，8.2% nycodenz梯度離心可有效懸浮HSC。新鮮分離的HSC經(jīng)Countess自動細胞計數(shù)儀得出平均HSC產(chǎn)量為（2.5±0.8）×106/g肝組織，活力為90.1%±3.8%（見表2）。初分離的HSC呈圓形，體積較小，胞內(nèi)含折光性較強的脂滴，在328 nm激發(fā)光下可見易淬滅的藍色自發(fā)熒光。油紅O染色顯示新分離貼壁1 d的HSC胞漿內(nèi)含大量紅色脂滴。隨機選擇10個視野計算GFAP染色陽性的細胞和總的藍色細胞核數(shù)，并獨立重復3次，顯示染色陽性細胞93.1%±1.5%。培養(yǎng)14 d的HSC失去脂滴，油紅O染色及328 nm自發(fā)熒光陰性，自發(fā)轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，表達特征性標志α-SMA。見圖2。

圖1 HC鑒定

2.3 KC分離、培養(yǎng)和鑒定 KC細胞種植在普通培養(yǎng)皿中30 min后，PBS清洗3次，去除未貼壁細胞。0.5%胰酶-EGTA消化貼壁的KC，經(jīng)Countess自動細胞計數(shù)儀得出每皿的細胞數(shù)，再乘以種植的總皿數(shù)，平均KC產(chǎn)量為（4.1±1.2）×106/g肝組織，活力為96.2%±2.7%（見表2）。KC貼壁4 h類似不規(guī)整圓形，隨機選擇10個視野計算CD68染色陽性的細胞和總的藍色細胞核數(shù)，并獨立重復3次，顯示染色陽性細胞95.1%±1.4%。吞噬聚苯乙烯微珠共聚焦成像顯示貼壁4 h的KC有強烈的吞噬能力，幾乎所有的細胞均吞噬含熒光標記的微珠。KC培養(yǎng)24 h后含有細長條型，帶有細長的尾絲，形態(tài)不規(guī)則，4 d出現(xiàn)含有多核的巨細胞，至14 d時仍為這種形態(tài)。培養(yǎng)至14 d時，KC仍具有吞噬能力，且表達CD68。見圖3。

3 討論

隨著體外肝臟細胞的共培養(yǎng)和肝臟組織工程的開展，為精確地研究各種肝臟細胞特定的功能，分離足量的高活力、高純度肝臟細胞是必要的。分離肝臟細胞的策略可分為2種：①單一地分離HC或NPCs；②同時分離HC和NPCs。單獨分離某種肝臟細胞已有報不少報道［2，8］，但同時分離肝臟多種細胞的文獻卻不多。

目前HC和NPCs的細胞分離方法，主要依據(jù)EGTA/膠原酶兩步法，先組織灌注，后低速離心［9-10］。正常HC周圍細胞外基質(zhì)成分很少，因此門靜脈灌注0.05%的膠原酶可以很容易地分離HC。HC為多邊形上皮細胞，占肝臟細胞總數(shù)的60%左右，直徑20～30 μm，密度在1.10至1.14 g/mL之間，直徑和密度在肝臟細胞中最大［11］，因此，低速離心可有效地初步沉淀HC。HC體積較大，易受灌流液、剪切力等損傷，活力常不高。本研究中HC量、活力和純度分別為（21±8.2）×106/g肝組織、92.1%±2.1%、96.5%± 2.2%，這與先前的研究［2，8］無明顯差別。HC在體外培養(yǎng)過程中，雖然仍表達CK-18，儲有糖原，但形態(tài)上類似成纖維細胞。

HSC位于SEC與HC之間的Disse腔，占肝臟細胞總數(shù)的6%，直徑10～12 μm，因胞內(nèi)含大量的維生素A，故密度在肝臟細胞中最輕，約為1.04～1.05 g/ mL［12-13］。FACS分選雖然可提供高純度的HSC，但這種方法的產(chǎn)量很低［14］。當前，密度梯度仍是分離HSC的主要方法。密度梯度可在1.067～1.053 g/mL之間選擇，但低密度1.053 g/mL（8.2%）可提高純度。HSC密度較低主要是因細胞內(nèi)含有大量脂滴，但是營養(yǎng)、年齡等會影響HSC脂滴的水平。研究［13］顯示老齡或富含維生素A營食的動物，HSC含脂滴較多，本研究選擇的是400～450 g的老齡大鼠，新分離的HSC平均得量為（2.5±0.8）×106/g肝組織，活力為90.1%±3.8%，純度為93.1%±1.5%。換算成總量，分離量接近理想狀態(tài)4×107～5 ×107/大鼠［14］；活力與純度與Pfeiffer等［9］和Liu等［10］的研究相當。HSC在體外培養(yǎng)過程中，細胞脂滴逐漸喪失，向成纖維細胞轉(zhuǎn)化，表達其特征指標α-SMA。

圖2 HSC鑒定

KC是肝臟的常駐巨噬細胞，構(gòu)成體內(nèi)最大的組織常駐巨噬細胞群，占肝臟細胞總數(shù)的15%，直徑在10～12 μm之間，密度為1.06～1.08 g/mL［8］。KC貼壁速度快，常在30 min內(nèi)完成［15-16］，本研究先貼壁30 min，PBS清洗未貼壁細胞后換液。KC的量、活力、純度分別為（4.1±1.2）×106/g肝組織、96.2%±2.7%、95.1%±1.4%，細胞量及純度足夠用于下游實驗。最近有研究［15，17］報道了原代混合HC培養(yǎng)分離的方法，經(jīng)隨后的分離傳代可獲得較高量和純度的KC，這簡化了KC分離，但這不適合同時分離肝臟多種細胞。KC的來源有2種可能：肝臟局部KC的增殖和循環(huán)的骨髓起源的單核細胞的募集［18］。本研究顯示KC可在體外增殖，培養(yǎng)14 d的KC亦表達CD68，具有吞噬功能，間接提示KC至少部分來源于肝臟局部KC的增殖。

本研究表明在膠原酶灌注基礎上聯(lián)用等密度離心、選擇性貼壁可以分離較高活力和純度的大鼠HC、HSC和KC。本法的最大優(yōu)點在于可以同時分離肝臟3種細胞，而且培養(yǎng)的細胞在體外可單層長期培養(yǎng)。然而，本研究也有不足之處，首先，HC體外培養(yǎng)我們未模擬體內(nèi)的3D培養(yǎng)，而3D培養(yǎng)可延緩HC去分化和功能喪失［19-20］；其次，HC與NPCs以及NPCs之間的穩(wěn)定共培養(yǎng)體系的建立還需進一步的實驗。

圖3 KC鑒定圖

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（本文編輯：丁敏嬌）

Isolation, identification and cultivation ofhepatocytes, hepatic stellate cells and Kupffer cells from rats

CAI Weixiang， FANG Jianfeng， ZHUANG Wei， LI Yumei. Department of Gastroenterology， Jiaxing Hospital of Zhejiang Armed Police Corps， Jiaxing， 324000

Objective: To establish a protocol for isolation， identification and cultivation of hepatocytes（HC）， hepatic stellate cells （HSC） and Kupffer cells （KC） from rats. Methods: By combining in situ perfusion with collagenase， density gradient centrifugation and selective adhension， primary HC， HSC and KC were obtained. Cell yield and viability were assessed by automated cell counter. The purity of these cells were detected with immunofl uorescent staining， special staining and phagocytosis assay. Results: The average yield， viability and purity of isolated HC were （21.0±8.2）×106/per gram liver， 92.1%±2.1%， and 96.5%±2.2%， respectively. The average yield， viability and purity of isolated HSC were （2.5±0.8）×106/per gram liver， 90.1%±3.8%， and 93.1%±1.5%， respectively. The average yield， viability and purity of isolated KC were （4.1±1.2）×106/per gram liver， 90.1%±3.8%， and 95.1%±1.4%， respectively. The isolated cells could be cultured in vitro for long-term. HSC underwent a gradual phenotypic transition to a myofibroblast-like phenotype with vitamin A losing in vitro culture. KC could proliferate， and had the ability of phagocytosis， and the expression of CD 68 at 14 d of culture. Conclusion: The simultaneous method is feasible to isolate and culture primary rat HC， HSC， and KC.

cell isolation； hepatocyte； hepatic stellate cell； Kupffer cell

·論著·

R575.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.09.004

2015-09-12

蔡偉祥（1978-），男，江蘇江陰人，主治醫(yī)師。