王小莉

（湖南吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000）

論 著

三葉青水提物對慢性阻塞性肺疾病大鼠IL-23和IL-17的影響

王小莉

（湖南吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000）

目的：研究三葉青水提物對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）大鼠白細胞介素23（IL-23）和白細胞介素17（IL-17）的影響及其作用機制。方法：清潔級健康雄性SD大鼠共30只，將其隨機分成對照組、模型組和三葉青組，每組10只。利用煙熏加氣管內(nèi)滴入脂多糖（LPS）復制COPD模型，第8天開始用三葉青水提物進行干預，28天后采集標本，觀察各組大鼠肺組織的病理變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-23和IL-17的表達情況。結(jié)果：血清中IL-23和IL-17的表達分別為模型組（25.38±1.25）ng/L、（63.78±4.98）ng/L，對照組（10.23±0.35）ng/L、（40.28±3.08）ng/L，三葉青組（15.79±2.38）ng/L、（49.97±3.65）ng/L，三組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。肺組織勻漿中的IL-23和IL-17表達分別為模型組（45.83±2.22）ng/L、（90.68±0.12）ng/L，對照組（16.39±1.14）ng/L、（56.23±1.24）ng/L，三葉青組（30.89±6.13）ng/L、（70.79±0.08）ng/L，三組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。BALF中的IL-23和IL-17表達分別為模型組（35.83±3.22）ng/L、（83.34±4.35）ng/L，對照組（14.68±1.14）ng/L、（52.17±3.92）ng/L，三葉青組（24.89±1.13）ng/L、（62.65±2.23）ng/L，三組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：三葉青水提物可降低COPD大鼠血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液中IL-23和IL-17的表達，對COPD炎癥的防治有重要的意義。

三葉青水提物；慢性阻塞性肺疾??；IL-23；IL-17

三葉青具有祛風化痰、活血止痛的作用［1］，用于治療支氣管炎、肺炎、咽喉炎及病毒性腦膜炎，外敷可治療扁桃體炎、蜂窩織炎和跌打損傷［2］。研究證明，三葉青提取物中含有黃酮類有機酸類和花青素類等成分，長期用于治療慢性阻塞性肺疾病，但機制未完全明了。本研究旨在通過三葉青水提物干預慢性阻塞性肺疾病大鼠，觀察IL-23和IL-17的改變，探討其治療慢性阻塞性肺疾病的炎癥機制。

1　方法與材料

實驗動物：清潔級健康SD雄性大鼠30只（湖南長沙開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供，動物編號HNACSDC20140293），體質(zhì)量（284±19）g，鼠齡12周。隨機分為對照組、模型組和三葉青組，每組10只。

制備慢性阻塞性肺疾病模型：采用氣管內(nèi)兩次滴注LPS和反復煙熏的方法制作COPD大鼠模型［3］。在第1天和第14天兩次向氣管內(nèi)緩慢滴注脂多糖200μg，將大鼠放入自制的有機玻璃煙熏箱內(nèi)其右上角開一直徑1cm的通氣孔，每天大鼠被動熏煙2次，每次時間30min，香煙16支（黃果樹牌香煙），2次間隔4h以上，共持續(xù)28天。整個過程是通過三通管將點燃的香煙的煙霧吸入100mL的注射器中，然后關閉吸煙通路一端，再打開三通管的另一端將煙霧注入煙熏箱內(nèi)，造成大鼠被動吸煙。三葉青組在吸煙8天后每天吸煙前利用灌胃針灌三葉青水提物1次，劑量為1.0g/kg，加生理鹽水至2mL，持續(xù)到實驗結(jié)束。對照組不熏煙，8天后給予等量的生理鹽水灌胃。模型組吸煙8天后給予等量的生理鹽水灌胃。3組均28天后處死。

制備三葉青水提物：三葉青采集于湖南吉首郊區(qū)。稱三葉青干燥全株1500g，將其切碎后浸泡，水煎3次，每次30min，將3次水濾液合并濃縮為每毫升1g，得到三葉青水提物。

采集血清：3組于第29天，以10%水合氯醛3.5mL/kg腹腔注射麻醉后，仰臥固定于操作臺，切開胸部，充分暴露出心臟和雙肺，用注射器心臟穿刺取血約5mL，室溫放置2h后，3500r/min離心10min，取血清于-20℃冰箱保存，用于IL-23和IL-17的檢測。

采集BALF：將大鼠右主支氣管結(jié)扎，用套管針穿刺至左肺，將3mL無菌生理鹽水緩慢注入左肺，再緩慢回抽，反復3次，回收灌注液，然后將灌洗液用紗布過濾放入無菌離心管中，于1500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，收集上清液得到BALF，－20℃凍存?zhèn)溆?，用于IL-23和IL-17的檢測。

制備肺組織勻漿：稱取右肺上葉組織500mg，加生理鹽水1.0mL，用組織勻漿器充分研磨，5000r/min離心10min，取上清液0.1mL，加生理鹽水至1.0mL，充分混勻，5000r/min離心10min，取上清液待測。

制備肺組織切片：取大鼠右中葉肺組織，包埋制成石蠟塊，然后切片進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織的病變特點。

檢測IL-23和IL-17的表達：應用IL-23和IL-17檢測試劑盒用酶聯(lián)免疫試驗對大鼠肺組織勻漿、血清和BALF進行檢測（ELISA試劑盒購買于武漢博士德生物有限公司）。

2　實驗結(jié)果

病理改變。肉眼觀察顯示模型組與正常組大鼠比較，雙肺顏色蒼白，體積增大，彈性減弱，肺組織HE染色光學顯微鏡下觀察，表現(xiàn)為支氣管壁黏膜上皮脫落、變性和壞死，不同程度的炎性細胞浸潤，肺泡壁不同程度變薄并有部分斷裂，肺泡擴張呈囊狀。三葉青組與模型組大鼠比較，可見支氣管壁炎癥程度有所減輕，肺泡擴張、囊泡形成情況較模型組減輕，但較對照組重。

各組血清中IL-23和IL-17表達見表1。

表1　各組大鼠血清中IL-23和IL-17表達比較 （ng/L，±s）

表1　各組大鼠血清中IL-23和IL-17表達比較 （ng/L，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組　別nIL-23IL-17對照組1010.23±0.3540.28±3.08模型組1025.38±1.25*63.78±4.98*三葉青組1015.79±2.38*△49.97±3.65*△

各組BALF中IL-23和IL-17表達見表2。

表2　各組大鼠BALF中IL-23和IL-17表達比較 （ng/L，±s）

表2　各組大鼠BALF中IL-23和IL-17表達比較 （ng/L，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組 別nIL-23IL-17對照組1014.68±1.1452.17±3.92模型組1035.83±3.22*83.34±4.35*三葉青組1024.89±1.13△62.65±2.23△

各組肺組織勻漿中IL-23和IL-17表達見表3。

表3　各組大鼠肺組織勻漿中IL-23和IL-17表達比較 （ng/L，±s）

表3　各組大鼠肺組織勻漿中IL-23和IL-17表達比較 （ng/L，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組 別nIL-23IL-17對照組1016.39±1.1456.23±1.24模型組1045.83±2.22*90.68±0.12*三葉青組1030.89±6.13△70.79±0.08△

3　討 論

慢性阻塞性肺疾病是各種炎癥細胞參與的全身異常炎癥反應性疾病， 以不完全可逆的氣流受限為主要特點［4］，其發(fā)病機制尚未完全明了，大量的研究表明氣道慢性炎癥在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。利用LPS和煙熏制作COPD模型，形態(tài)學結(jié)果顯示大鼠具有明顯的慢性支氣管炎和肺氣腫的改變，利用三葉青水提物干預后氣道炎癥和肺氣腫的形態(tài)學有較明顯的改變，表明三葉青能夠有效地減輕COPD的炎癥程度。

近年來，血清白介素-17（IL-17）、白介素-23（IL-23）與慢阻肺的病情程度關系受到臨床研究關注［5］。血清IL-17、IL-23可反映慢阻肺炎性反應程度，與病情程度存在一定的關系［6］。IL-23是由多種組織及細胞分泌的一種炎癥因子。IL-23在COPD、肺炎鏈球菌感染、牙周疾病及炎癥性腸病性關節(jié)炎等疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中均扮演著不可忽視的角色［7-8］。本研究結(jié)果顯示，模型組血清、肺勻漿組織及BALF中的IL-23與對照組比較顯著增高，提示IL-23與COPD的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關性。利用三葉青提取物干預后大鼠血清、肺勻漿組織和BALF中的IL-23表達明顯下降，提示三葉青可以抑制炎癥介質(zhì)IL-23的釋放。

Th17是一類近些年來發(fā)現(xiàn)的淋巴細胞亞群，其主要分泌 IL-17，發(fā)揮相應的效應。相關研究證實，在自身免疫性疾病及炎癥性疾病中，特別是膿毒癥中，其外周血中Th17細胞比例及IL-17明顯高于健康對照者，并且隨著疾病嚴重程度的加重，Th17細胞數(shù)量及IL-17水平也明顯增加［9］。IL-17是誘導炎癥反應的啟動因子，可以促進C-X-C趨化因子誘導中性粒細胞在呼吸道的激活和募集，參與氣道炎癥。研究表明IL-17與包括感染性疾病、哮喘在內(nèi)的多種疾病密切相關［10］，COPD患者呼吸道IL-17A/F的表達是上調(diào)的，且IL-17A基因缺失降低香煙煙霧引起的炎癥和肺泡Ⅱ型細胞凋亡［11］。有研究顯示，COPD患者外周血中Th17細胞數(shù)量及IL-17水平較正常對照者顯著升高，提示Th17在COPD的發(fā)病過程中起著重要的作用［12］。Kristina等［13］報道慢阻肺急性加重期造模小鼠肺組織中IL-17mRNA的水平明顯升高，并且伴有明顯的中性粒細胞浸潤，在給予IL-17抗體后小鼠肺組織中的中性粒細胞浸潤明顯減少。本實驗中COPD模型組血清、肺勻漿組織及BALF中IL-17濃度與對照組比較明顯增高，三葉青水提物干預后IL-17水平的降低，提示IL-17與COPD的形成過程有密切聯(lián)系，三葉青對COPD炎癥介質(zhì)IL-17有一定的抑制作用。通過檢測外周血Th17細胞水平，其不僅可作為評判COPD癥狀嚴重程度，還可能為其治療提供新的靶點。

綜上所述，IL-23和IL-17參與了COPD的發(fā)病過程，三葉青提取物可通過對IL-23和IL-17的抑制，減輕COPD氣道炎癥及肺氣腫程度，使炎癥細胞的聚集和趨化程度減輕。

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Objective：To evaluate the effect and molecular mechanism of extracts of Sanyeqing in preventing experimental chronic obstructive pulmonary diseases in rats through measuring IL-23 and IL-17.Method：30 SD rats were divided into three groups evenly in random， including the control group， the model group and the Sanyeqing group. COPD model was replicated by exposion to cigarette smoke and endotracheal instillation of LPS， intervened by extracts of Sanyeqing at the 8th day. After 28 days， the specimens were collected to observe thepathological changes in lung tissue and to detect the expression of of IL-23 and IL-17 in serum， lung tissue and BALF by ELISA. Result： The expression of IL-23 and IL-17 in serum was 25.38±1.25ng/L and 63.78±4.98ng/L in the model group， 10.23±0.35ng/L and 40.28±3.08ng/L in the control group and 15.79±2.38ng/L and 49.97±3.65ng/L in the Sanyeqing group. There was statistical significance among the three groups in multiple comparison（P＜0.05）. The expression of IL-23 and IL-17 in lung tissue was 45.83±2.22ng/L and 90.68±0.12ng/L in the model group， 16.39±1.14ng/L and 56.23±1.24ng/L in the control group， 30.89±6.13ng/L and 70.79±0.08ng/L in the Sanyeqing treatment group. There was statistical significance among the three groups in multiple comparison（P＜0.05）. The expression of IL-23 and IL-17 in BALF in the model group was 35.83±3.22ng/L and 83.34±4.35ng/L， 14.68±1.14ng/L and 52.17±3.92ng/L in the control group comparison and 24.89±1.13ng/L and 62.65±2.23ng/ L in the Sanyeqing group. There was statistical significance among the three groups in multiple comparison（P＜0.05）. Conclusion：Sanyeqing could decrease the expression of IL-17 and IL-23 in serum， lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid， which has important significance in preventing and treating chronic obstructive pulmonary diseases.

Extracts of Sanyeqing；Chronic obstructive pulmonary diseases；IL-23；IL-17

R256.126.225

B

1004-2814（2016）09-0848-03

2016-04-22

湖南省衛(wèi)生廳科研課題編號（B2014-068），湖南省科技廳項目（2014SK3010）