姚茹冰，王圓圓，蔡輝

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京　210002)

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脂多糖對類風濕關節(jié)炎外周血單核細胞Toll樣受體4、髓樣分化因子88蛋白表達的影響

姚茹冰，王圓圓，蔡輝

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，江蘇 南京210002)

目的觀察脂多糖(LPS)對類風濕關節(jié)炎(RA)患者外周血單核細胞Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)蛋白表達的影響。方法采用活動期RA患者外周血進行單核細胞的分離培養(yǎng)，并與健康志愿者做對照。分為以下5組觀察：健康對照組、健康+LPS組、RA對照組、RA+ LPS組、RA+LPS+TAK-242組，并采用Western blot法檢測各組TLR4、 MyD88蛋白的表達。結(jié)果健康+LPS組或RA+LPS組TLR4、MyD88蛋白表達與健康對照組或RA對照組比較均明顯升高(均P<0.01)；RA對照組或RA+LPS組TLR4、MyD88蛋白表達與健康對照組或健康+LPS組比較均明顯升高(均P<0.01);RA+LPS+TAK-242組TLR4、MyD88蛋白表達與RA+LPS組比較明顯降低(均P<0.01)。結(jié)論RA活動期單核細胞可能存在TLR/MyD88信號通路的激活，且對LPS的刺激反應性增強。

關節(jié)炎,類風濕;脂多糖類;Toll樣受體2;Toll樣受體4;髓樣分化因子88

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類重要的模式識別受體，每種受體通過特定識別來源于病毒，細菌和真菌等“病原體相關模式分子”(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，察覺微生物感染的存在，激發(fā)啟動機體免疫反應，是先天性免疫重要的跨膜受體和信號轉(zhuǎn)導受體[1]。其中TLR4是革蘭陰性細菌細胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的識別受體，主要表達于髓系單核細胞[2]。類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以關節(jié)滑膜炎癥為主要特征的高度致殘性自身免疫性疫病[3]，TLR4對RA的發(fā)生發(fā)展起重要作用，TLR3和TLR4在慢性RA患者關節(jié)滑膜成纖維細胞中高表達[4]；RA關節(jié)腔滑液中巨噬細胞高表達TLR2和TLR4[5]；Toll樣受體不僅存在于RA滑膜組織，而且在外周血單核細胞中也存在[6]。本文通過LPS刺激RA患者外周血單核細胞，觀察對TLR4、MyD88蛋白表達的影響，以期進一步為RA靶向TLR4的治療提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對象選取 2014 年 4 月至 2015 年 1 月南京軍區(qū)南京總醫(yī)院就診的活動期 RA患者5例(DAS28≥2.6)，均符合 2010 年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯(lián)盟(ACR/EULAR)分類標準。其中男1例，女4例，年齡 25～79歲，平均年齡(52.2±19.5)歲。同時選取5例健康志愿者為對照組，其中男 2例，女3 例，年齡29～40歲，平均年齡(34.2±4.8)歲，所有研究對象均需排除血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及其他自身免疫疾病等。

1.2試劑與儀器人外周血淋巴細胞分離液，天津灝洋生物有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基，美國HYCLONE 公司；LPS 試劑，Sigma公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；GAPDH(FL-335)、TLR4抗體(H-80)，美國Santa Cruz公司；MyD88(D80F5) 抗體，美國CST公司；Western 電泳儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機，美國科俊儀器公司。

1.3人外周血淋巴細胞分離、培養(yǎng)RA患者及健康志愿者于清晨空腹時抽取8 mL靜脈全血，肝素抗凝。利用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)后，將分離的PBMCs調(diào)整細胞濃度至5×109·L-1，接種于 24 孔細胞培養(yǎng)板，每孔 1 mL，置于 37 ℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h。細胞培養(yǎng) 4 h 后，棄細胞培養(yǎng)上清，將 37 ℃預熱 PBS 輕洗細胞培養(yǎng)板 2 遍，洗脫未貼壁的細胞，獲得貼壁的單核細胞。RPMI-1640 完全培養(yǎng)基重懸(含 1×105U·L-1青霉素，100 μg·L-1鏈霉素，10%胎牛血清)細胞。分為下列5組觀察：(1)健康對照組：健康志愿者外周血單核細胞，不給予任何藥物干預；(2)健康+LPS組：健康志愿者外周血單核細胞，給予終濃度為 100 μg·L-1LPS 干預；(3)RA對照組：RA活動期患者外周血單核細胞，不給予任何藥物干預；(4)RA+ LPS組：RA活動期患者外周血單核細胞，給予終濃度為 100 μg·L-1LPS 干預；(5)RA+LPS+TAK-242組：RA活動期患者外周血單核細胞，給予終濃度為100 μg·L-1LPS及1000 ng·L-1TAK-242干預。置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收獲細胞。

1.4western blot法檢測外周血單核細胞TLR4及MyD88蛋白的表達用等量的蛋白樣本(50 μg)進行SDS-PAGE凝膠電泳，進行濕法轉(zhuǎn)膜，在5% 脫脂奶粉封閉液中封閉(4℃，過夜)，棄去封閉液。加入封閉液稀釋好的TLR4、MyD88抗體及GAPDH抗體(1∶1 000)，TBST漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與辣根過氧化酶標記的二抗(1∶5 000)，室溫下?lián)u蕩孵育2 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。顯影液置膜上，凝膠成像儀成像。GAPDH表達作為內(nèi)參蛋白，得出TLR4 / GAPDH，MyD88 / GAPDH的比值，用于統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果

2.1LPS對外周血單核細胞TLR4蛋白表達的影響健康對照組及RA對照組外周血單核細胞給予LPS刺激后， TLR4蛋白表達均明顯升高(均P<0.01)；RA患者加入LPS刺激的同時加入TAK-242(TLR4抑制劑)，TLR4蛋白表達可明顯降低(P<0.01)；與健康對照組比較，RA對照組TLR4蛋白表達明顯升高；與健康+LPS 組比較，RA+LPS 組TLR4蛋白表達也明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1　LPS對外周血單核細胞TLR4蛋白表達的影響±s

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與RA對照組比較，bP<0.01；與RA+LPS 組比較，cP<0.01；與健康+LPS 組比較，dP<0.01。

2.2LPS對外周血單核細胞Myd88蛋白表達的影響健康對照組及RA對照組外周血單核細胞給予LPS刺激后，Myd88蛋白表達均明顯升高(均P<0.01)；RA患者加入LPS刺激的同時加入TAK-242(TLR4抑制劑)，Myd88蛋白表達可明顯降低(P<0.01)；與健康對照組比較，RA對照組Myd88蛋白表達明顯升高；與健康+LPS 組比較，RA+LPS 組Myd88蛋白表達也明顯升高(P<0.01)。見表2。

表2　 LPS對外周血單核細胞Myd88蛋白表達的影響

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與RA對照組比較，bP<0.01；與RA+LPS 組比較，cP<0.01；與健康+LPS 組比較，dP<0.01。

3　討論

RA是一種以對稱性多滑膜關節(jié)炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的慢性自身免疫病，病因及發(fā)病機制不明[7]。一般認為其發(fā)病可能與溶血性鏈球菌或其他細菌代謝產(chǎn)物、病毒等的持續(xù)感染引起遺傳易感個體的自身免疫反應密切相關[8]。TLRs不僅在固有免疫中具有重要作用，也是聯(lián)系固有免疫與適應性免疫的橋梁，而且從多方面影響適應性免疫應答，在RA發(fā)病機制中可能有重要的作用[9]。TLR的生物學效應主要由髓樣分化反應蛋白88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴型和非MyD88依賴型傳導途徑介導[10]。MyD88是一種接頭分子，除了TLR3， MyD88與其它所有TLR相關。研究提示，TLR尤其是TLR4及其介導的TLR4/ MyD88信號通路在RA的發(fā)病中有重要的作用。LPS是脂質(zhì)和多糖的復合物，為革蘭氏陰性細菌外壁層中特有的一種化學成分，是TLR4經(jīng)典的外源性配體[11]。Kowalski等研究提示相比較健康人和骨關節(jié)炎患者，新近診斷的RA患者的外周血單個核細胞對LPS的刺激反應性增高；錢雷等[12]研究提示RA患者外周血單個核細胞的TLR4表達及對脂多糖的刺激的反應性增加，且具有較強的誘導Th 17細胞分化能力，都與本文的結(jié)果有相似之處[13]。不同之處主要在于，考慮到RA活動期患者促炎細胞因子分泌相對增多，炎癥通路相對明顯激活，本文研究對象選擇了活動性RA患者的外周血單核細胞，不只局限于新近診斷RA或單純的確診的RA的外周血單個核細胞。本文研究結(jié)果提示，健康+LPS組、RA+LPS組TLR4、MyD88蛋白表達均比LPS刺激前的健康對照組、RA對照組明顯升高；活動期類風濕關節(jié)炎患者外周血單核細胞TLR4mRNA、Myd88蛋白表達，無論是在LPS刺激前與健康對照組比較，還是LPS刺激后與健康+LPS組比較均明顯增高，且這種反應性可被TLR4抑制劑TAK-242抑制。

本實驗顯示，活動期RA患者外周血單核細胞TLR4、MyD88蛋白表達增高，對TLR4經(jīng)典的外源性配體LPS刺激反應性較高，可能存在TLR4/MyD88信號通路的激活，且該通路可被TLR4抑制劑TAK-242抑制[14]，為今后研究靶向TLR4/MyD88信號通路治療RA提供了一定的實驗依據(jù)，確切機制仍需進一步深入研究證實。

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Effect of lipopolysaccharide on expression of TLR4 and MyD88proteinin peripheral blood monocytes cells of rheumatoid arthritis

YAO Rubing，WANG Yuanyuan，CAI Hui

(DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing,Jiangsu210002,China)

ObjectiveTo observe the effect of lipopolysaccharide(LPS) on expression of TLR4 and MyD88 protein in peripheral blood monocytes cells of rheumatoid arthritis(RA).MethodsPeripheral blood monocytes cells of active RA patients were isolated and cultured,healthy volunteers as control.Specimen were assignedinto the following five groups:the healthy control group,health + LPS group,RA control group,RA + LPS group,and RA + LPS + TAK-242 group.The expressions of TLR4 and MyD88 protein were detected by Western blot.ResultsThe expressions of TLR4，MyD88 protein in health + LPS group or in RA + LPS groupwere significantly higher than those in healthy control group or in RA control group(allP<0.01).The expressions in RA control group or in RA + LPS group were significantly higher than those in healthy control group or health + LPS group(allP<0.01).The expressions in RA + LPS + TAK-242 group were significantly lower than those in RA + LPS group(allP<0.01).ConclusionMonocytes cells of active RA patients may haveTLR / MyD88 signaling pathway activation and their reactivity to LPS stimulation is increased.

Arthritis,rheumatoid;Lipopolysaccharides;Toll-like receptor 2;Toll-like receptor 4;Myeloid differentiation factor 88

國家自然科學基金青年科學基金項目(81303124)

蔡輝，男，教授，博士生導師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合風濕病，E-mail:njzy_caihui@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.016

2016-01-09，

2016-04-18)