劉曉薇謝一舟盧奎林陳品全黃潔朱席德慧

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610064；2.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司 四川成都 610065）

人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法驗證及應(yīng)用

劉曉薇1，2謝一舟2盧奎林2陳品全2黃潔2朱2席德慧1*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610064；2.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司 四川成都 610065）

本文參照藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則， 在驗證中對專屬性、線性、準確度、中間精密度、重復(fù)性和范圍6個參數(shù)進行確認，以考察成都蓉生藥業(yè)有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ（Antithrombin III， ATIII）效價檢測方法是否符合要求。通過驗證，人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法在專屬性、線性、準確度、中間精密度、重復(fù)性和范圍6個方面均符合要求，因此此方法可用于成都蓉生藥業(yè)有限公司人抗凝血酶Ⅲ效價檢測。通過驗證確認人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法的檢測范圍是0.0057-0.0130IU/ml。

人抗凝血酶Ⅲ 效價

人抗凝血酶III屬于血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine Protase Inhibitors， Serpins）。是血漿生理性抑制物中最重要的抗凝物，其抗凝作用大約占體內(nèi)總抗凝作用的70%。在血漿中，ATIII通過與FXa、FIIa等活化凝血因子（酶形式）形成共價復(fù)合物，導(dǎo)致其酶活性失活，起到抑制凝血因子酶活性的作用，防止血栓的形成，從而起到調(diào)節(jié)血凝平衡的作用。ATIII自上世紀80年代應(yīng)用于臨床以來已成為臨床急救用藥，可用于ATIII遺傳性缺陷患者在懷孕、分娩及大手術(shù)前以預(yù)防血栓發(fā)生，也可用于重癥感染患者、彌撒性血管內(nèi)凝血患者等獲得性ATIII缺乏患者的緊急治療。

根據(jù)藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則，在對藥品分析方法展開的驗證內(nèi)容一般包括：專屬性、準確度、精密度（涵蓋三類：重復(fù)性、中間精密度以及重現(xiàn)性）、耐用性、線性、檢測限、定量線以及范圍［1］。在驗證實施時可依據(jù)實際情況對驗證的內(nèi)容進行設(shè)定［2］。

本文介紹了對成都蓉生藥業(yè)有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法的驗證及其應(yīng)用。所驗證的方法是：將供試品中加入過量凝血酶，使抗凝血酶與凝血酶形成1：1復(fù)合物，剩余的凝血酶作用于發(fā)色底物S-2238，釋出顯色基團對硝基苯胺（PNA）。顯色的深淺與剩余凝血酶呈正相關(guān)，而與人抗凝血酶Ⅲ呈負相關(guān)，根據(jù)樣品吸光度值，從標準曲線中計算出人抗凝血酶Ⅲ的活性。

1 材料與設(shè)備

蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復(fù)溶血漿、S-2238試劑、肝素鈉試劑、人抗凝血酶試劑、牛血清蛋白試劑、純化水、人抗凝血酶成品、甘氨酸、枸櫞酸。50-200ul單通道移液器（芬蘭雷柏）、100-1000ul單通道移液器（芬蘭雷柏）、萬分之一分析天平（梅特勒-托利多）、恒溫水浴箱（精宏）、Power Wave TM XS2酶標儀（Bio-Tek）。

2 實驗方法

人抗凝血酶Ⅲ效價檢測驗證方案。

2.1.1 專屬性確認

測定次數(shù) 　預(yù)估值（I U / m l） 　檢測值（I U / m l） 　回收率（%） 　可接受標準1 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 9 2 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 9 3 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 4 4 　1 . 1 0 　1 . 0 4 　9 4 . 6 5 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 6 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 7 　1 . 1 0 　1 . 0 7 　9 7 . 2回收率為8 5 % -1 1 5 % 8 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 5 9 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 1 0 　1 . 1 0 　1 . 0 1 　9 1 . 6 1 1 　1 . 1 0 　0 . 9 9 　8 9 . 8 1 2 　1 . 1 0 　0 . 9 9 　8 9 . 8

配制濃度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l）標準溶液相關(guān)系數(shù)r2　可接受標準試驗次數(shù) 　O D值1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 7 2 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 2 　0 . 0 0 8 1 　0 . 0 0 9 5 　0 . 0 1 1 9 　0 . 9 8 7 r2≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 3 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 8 0 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 3 3 　0 . 9 9 7配制濃度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l）樣品實測相關(guān)系數(shù)r2　可接受標準試驗次數(shù) 　O D值1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 0 2 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 7 9 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 2 8 　0 . 9 9 0 r2≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 7 2 　0 . 0 0 9 2 　0 . 0 1 1 0 　0 . 9 8 7試驗次數(shù) 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l） 　　相關(guān)系數(shù)r 　　可接受標準樣品實測效價相關(guān)系數(shù)r 1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 0 2 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 7 9 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 2 8 　0 . 9 9 5 r≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 7 2 　0 . 0 0 9 2 　0 . 0 1 1 8 　0 . 9 8 9測定次數(shù) 　0 . 0 0 5 5 I U / m l 　0 . 0 0 6 7 I U / m l 　0 . 0 1 7 0 I U / m l 　　可接受標準樣品實測回收率（%）1 　1 0 5 . 3 　9 6 . 4 　1 0 4 . 3 2 　1 1 1 . 8 　1 0 5 . 7 　9 9 . 4回收率為8 5 % -1 1 5 % 3 　1 1 0 . 8 　1 0 3 . 7 　1 0 1 . 8

樣品濃度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0檢測結(jié)果（I U / m l） 　0 . 0 0 5 8 　0 . 0 0 6 1 　0 . 0 0 6 1 　0 . 0 0 6 4 　0 . 0 0 7 1 　0 . 0 0 6 9 　0 . 0 1 7 7 　0 . 0 1 6 9 　0 . 0 1 7 3平均值 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 1 7 0 S D 　0 . 0 0 0 1 9 　0 . 0 0 0 3 3 　0 . 0 0 0 4 1 R S D（%） 　3 . 2 　4 . 8 　2 . 4試驗日期 　2 0 1 4 -0 9 -1 4 　2 0 1 4 -0 9 -1 5 　2 0 1 4 -0 9 -1 6 　2 0 1 4 -0 9 -1 7 　2 0 1 4 -0 9 -1 8 　2 0 1 4 -0 9 -1 9試驗結(jié)果（I U / m l） 　　檢測員B 　5 7 . 8 　5 5 . 0 　5 7 . 8 　5 7 . 8 　5 7 . 7 　5 6 . 3檢測員A 　5 6 . 7 　5 6 . 3 　5 9 . 6 　5 7 . 0 　5 7 . 5 　5 6 . 4 1 2次數(shù)據(jù)R S D 　2 . 0 %方差分析（F檢驗） 　　日期因素 　F值 　0 . 1 2 2 7 0 3 　P值 　0 . 7 4人員因素 　F值 　3 . 1 7 3 8 4 6 　P值 　0 . 1 2可接受標準 　　人員和日期兩因素在α = 0 . 0 5水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0 . 0 5）R S D≤1 0 . 0 %線性確認結(jié)果樣品實測效價（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 0 8 0 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 3 0線性相關(guān)系數(shù)r2　0 . 9 9 1準確度確認結(jié)果樣品實測效價（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0準確度/回收率（%） 　1 0 4 . 2重復(fù)性確認結(jié)果樣品實測效價（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0 R S D值（%） 　3 . 5

將人抗凝血酶Ⅲ成品效價配制為1.1IU/ml，與理論效價值為1.1IU/ml的蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復(fù)溶血漿配制成1：1溶液，得到混合樣品。檢測混合樣品的人抗凝血酶Ⅲ效價并計算回收率。確認用酶標儀測定人抗凝血酶Ⅲ效價是否受到配制原液的基質(zhì)干擾。混合樣品的人抗凝血酶Ⅲ效價回收率范圍應(yīng)在85%～115%。

2.1.2 線性確認

用純化水將蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復(fù)溶血漿配制成效價為0. 005、0.0057、0.0067、0.008、0.01IU/ml的溶液；另用純化水將人抗凝血酶Ⅲ樣品配制成各因子效價為0.005、0.0057、0.0067、0.008、0. 01IU/ml的溶液。對上述樣品進行3次檢測。確認蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復(fù)溶血漿和人抗凝血酶Ⅲ樣品配制濃度與檢測OD值是否成線性關(guān)系。蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ復(fù)溶血漿和人抗凝血酶Ⅲ樣品線性回歸系數(shù)r2≥0.9800。

2.1.3 準確性確認

將人抗凝血酶Ⅲ樣品配制成效價為0.005、0.0067、0.01IU/ml的溶液，對樣品進行3次檢測。計算回收率。確認人抗凝血酶Ⅲ樣品的準確度是否符合要求?；厥章蕬?yīng)為85%～1115%。

2.1.4 重復(fù)性確認

將人抗凝血酶Ⅲ樣品配制成效價為0.005、0.0067、0.01IU/ml的溶液，對樣品進行3次檢測。計算每個濃度三個結(jié)果的RSD。確認由同一分析人員在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內(nèi)所得測定結(jié)果之間的精密度是否達到可接受標準要求?？山邮軜藴蕿镽SD≤15.0%。

2.1.5 中間精密度確認

取人抗凝血酶Ⅲ樣品，由不同的人員對人抗凝血酶Ⅲ的效價進行檢測。共檢測6次，每天一次。取2人總共12次測定結(jié)果計算其相對標準偏差（RSD）。對測定結(jié)果進行方差分析，對人員和日期兩因素進行F檢驗。確認在不同分析人員和不同日期兩種因素影響下測定同一樣品時，兩分析人員在不同日期測定結(jié)果的精密度是否達到可接受標準。兩位分析人員的測定結(jié)果相互符合的程度是否達到可接受標準要求，不同日期的檢測結(jié)果相互符合程度是否達到可接受標準。 可接受標準為（1）RSD≤15.0%；（2）經(jīng)F檢驗后，人員和日期兩因素在α=0.05水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0.05）。

2.1.6 范圍確認

根據(jù)以上線性，重復(fù)性和準確性的試驗結(jié)果，就可推論出該檢測方法能夠測定的人抗凝血酶Ⅲ效價的區(qū)間。滿足線性r≥0.98，回收率應(yīng)為85%～115%，重復(fù)性RSD≤15.0%的人抗凝血酶Ⅲ效價的最高值和最低值之間的區(qū)間即為該檢測方法的范圍。

3 實驗結(jié)果

3.1.1專屬性確認

3.1.2 線性確認

2.1.3 準確性確認

2.1.4 重復(fù)性確認

2.1.5 中間精密度確認

人員和日期兩因素在α=0.05水平上均對方法精密度無顯著性影響（P＞0.05）

2.1.6 范圍確認

驗證結(jié)果：該方法的檢測范圍為：0.0057-0.0130IU/ml。

4 討論

本文的總體思路是對成都蓉生藥業(yè)有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法展開驗證，確定是否適用于本實驗室新產(chǎn)品活性檢測。由于在人抗凝血酶Ⅲ成品中添加甘氨酸作為穩(wěn)定劑，在專屬性檢測中考察了它是否會干擾該方法的測定。通過驗證結(jié)果得知該方法的檢測范圍是0.0057-0.0130IU/ml，可給予其他實驗室的方法驗證和設(shè)計提供一個參考，同時獲得了產(chǎn)品驗證過程中涉及的一系列參數(shù)，從而保證結(jié)果的穩(wěn)定和有效，對人抗凝血酶Ⅲ成品的工藝研究提供可靠的數(shù)據(jù)支撐，讓更多人抗凝血酶Ⅲ缺乏病患能夠得到一定治療。

驗證開始需要對使用的計量器具的校驗有效日期進行驗證，這直接關(guān)系到整個實驗結(jié)構(gòu)是否具備有效性。今后還需要進一步探討各種人抗凝血酶Ⅲ效價檢測方法的優(yōu)缺點，建立新的實驗方案和設(shè)計，選擇于本實驗室條件下效果最優(yōu)的。參考文獻

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［2］周志軍，李策生，李陶敬等.檢測人凝血因子Ⅷ 蛋白質(zhì)含量的BCA法的優(yōu)化及驗證［J］.中國生物制品學(xué)，2013，26（10） .

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R917

A

1674-2060（2016）02-0169-02

劉曉薇（1987—），女，漢族，四川成都人，?，F(xiàn)從事于血液制品行業(yè)，就職于成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，具有7年的生產(chǎn)工作經(jīng)驗，同時為四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2012級在職研究生。