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        人類白細(xì)胞介素-2與白細(xì)胞介素-7對(duì)體外誘導(dǎo)抗原肽SLYNTVAT 特異性T淋巴細(xì)胞的影響

        2016-10-27 03:47:48朱建蒙
        生物技術(shù)世界 2016年2期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        朱建蒙

        (廣西醫(yī)科大學(xué) 廣西南寧 530000)

        人類白細(xì)胞介素-2與白細(xì)胞介素-7對(duì)體外誘導(dǎo)抗原肽SLYNTVAT 特異性T淋巴細(xì)胞的影響

        朱建蒙

        (廣西醫(yī)科大學(xué) 廣西南寧 530000)

        目的:優(yōu)化人類白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)與白細(xì)胞介素-7(rhIL-7)在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)SLYNTVAT(SL9)抗原特異性T細(xì)胞時(shí)的用量。方法:分離健康人外周血PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞,培養(yǎng)T2(TAP缺陷T淋巴細(xì)胞)細(xì)胞并加載HIV來源抗原肽作為刺激細(xì)胞。SL9抗原肽四聚體檢測(cè)不同細(xì)胞因子用量下特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)頻率大小。結(jié)論:rhIL-7在誘導(dǎo)SL9抗原特異性T細(xì)胞中起到關(guān)鍵促進(jìn)作用,SL9 特異性T淋巴細(xì)胞能夠自身分泌大量rhIL-2,減少rhIL-2用量可為體外誘導(dǎo)培養(yǎng)SL9特異性T淋巴細(xì)胞提高效率。

        SLYNTVAT 特異性T淋巴細(xì)胞 白細(xì)胞介素

        通過長(zhǎng)期混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的方法能夠誘導(dǎo)出同種抗原肽-MHC特異性的T 細(xì)胞[1],肽四聚體技術(shù)目前被看做檢測(cè)特異性CTL的金標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。一般研究者體外誘導(dǎo)特異性CTL時(shí)均認(rèn)為rhIL2在維持T細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖中起到重要作用,為誘導(dǎo)特異性CTL必不可少的細(xì)胞因子[3]。本研究通過加入不同量rhIL-2與rhIL-7進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)SL9抗原特異性T細(xì)胞,構(gòu)建SL9抗原肽四聚體并檢測(cè)不同細(xì)胞因子用量下特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)頻率。證明rhIL-7在誘導(dǎo)SL9抗原特異性T細(xì)胞時(shí)起到更重要作用。

        1 材料和方法

        1.1 主要儀器與試劑

        T2細(xì)胞購(gòu)自于上海復(fù)祥生物科技有限公司,RPMI Medium 1640從Gibco公司購(gòu)買,胎牛血清為Hyclone公司生產(chǎn)。PE標(biāo)記鏈酶親和素抗體購(gòu)自于Sigma公司,生物素化MHC-SL9肽四聚體單體由北京曠博生物公司合成。PBMC來源于HLA-A2陽(yáng)性志愿者外周血,無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自于照生公司,淋巴細(xì)胞分離液由索來寶公司提供??乖腟L9由杭州中肽公司合成。

        1.2 抗原肽SL9加載T2細(xì)胞

        培養(yǎng)T2細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml備用。在24孔板中,每孔加入1ml調(diào)整濃度后的T2細(xì)胞。各孔中加入特異性抗原肽SL9,終濃度40μg/ml。6 h后X射線200Gy輻照,1500rpm 5min離心收集細(xì)胞,無血清1640培養(yǎng)基重懸備用。

        1.3 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)SL9特異性CTL

        健康人外周血Ficoll-Hypaque法分離PBMC后在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁2 h得到T淋巴細(xì)胞。加載SL9抗原肽T2細(xì)胞與PBL(外周血T淋巴細(xì)胞)以1:10的比例在完全T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)?;旌狭馨图?xì)胞分為三組培養(yǎng)。第一組:每三天加入rhIL7(終濃度10ng/ ml),每一周用加載SL9抗原肽T2細(xì)胞重新刺激。第二組:開始培養(yǎng)的三天加入rhIL2(終濃度50U/ml),三天后加入rhIL7;以后每三天輪流加入rhIL2或rhIL7。第三組:開始培養(yǎng)的三天加入rhIL2,以后每三天均加入rhIL7。

        1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SL9特異性CTL

        T細(xì)胞用CD8單克隆抗體與PE-MHC肽四聚體染色后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙染陽(yáng)性頻率。用Graphpad進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        2 結(jié)果

        抗原肽SL9加載T2細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)HLA-1類分子,第三組誘導(dǎo)方案可得到最大量特異性CTL,經(jīng)過兩周的誘導(dǎo)最大特異性CTL檢測(cè)頻率為12.4%。

        圖1 加載SL9抗原肽的T2細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)HLA-I類分子

        圖2 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明經(jīng)過兩周培養(yǎng)后,第三組混合淋巴細(xì)胞特異性CTL頻率最高,即在誘導(dǎo)最初加入rhIL-2,以后每三天均加入rhIL-7,最高檢出頻率為12.4%。

        3 討論

        抗原特異性T細(xì)胞在疾病發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用[4]。在H I V病毒感染后長(zhǎng)期無病程進(jìn)展的患者血中可檢測(cè)到高頻率的CD8+T細(xì)胞[5]。對(duì)抗原特異性T細(xì)胞的研究有利于研究病毒性疾病病理進(jìn)展和疫苗開發(fā)。HIV p17Gag蛋白來源抗原肽SLYNTVATL有著嚴(yán)格的生物學(xué)限制性,研究表明當(dāng)HIV病毒產(chǎn)生對(duì)SL9特異性CTL產(chǎn)生免疫逃避后,將引起患者病毒大量復(fù)制[6]。提高SL9特異性CTL體外誘導(dǎo)效率可能有助于對(duì)疾病機(jī)理的研究與治療。

        [1]Y.J. GUO, Y. ZHU, S.H. SUN. Identification and functional studies of HLA-A0201 restricted CTL epitopes in the X protein of hepatitis B virus. Acta Virol 2011, 55(2):107-15.

        [2]Dries Van Hemelen, Vera Mahler, Gottfried Fischer, et al. HLA-class II peptide tetramers vs. allergen-induced proliferation for identification of allergen-specific CD4 T cells.Allergy. 2015 Jan;70(1):49-58.

        [3]Angel Varela-Rohena1, Peter E Molloy2, Steven M Dunn,et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nat Med. 2008 Dec;14(12):1390-5.

        [4]Goulder, P.J. & Watkins, D.I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design.Nat. Rev. Immunol. 2004 4, 630 640.

        [5]Varela-Rohena A, Molloy PE, Dunn SM,et al. Nat Med. 2008 Dec;14(12):1390-5.

        [6]Morikawa, Y., Zhang, W.H., Hockley, D.J., Nermut, M.V. & Jones,I.M. Detection of a trimeric human immunodeficiency virus type 1 Gag intermediate is dependent on sequences in the matrix protein, p17. J. Virol. 1998 ,72, 76597663.

        Q2

        A

        1674-2060(2016)02-0324-01

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