周　靜　張保朝

(南陽市中心醫(yī)院腦血管介入科，河南　南陽　473000)

?

miR-206對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

周靜張保朝1

(南陽市中心醫(yī)院腦血管介入科，河南南陽473000)

目的探討 miR-206 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。方法通過實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織、正常成人腦組織、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251以及正常人腦膠質(zhì)細(xì)胞(HEB)中miR-206的表達(dá)情況。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-206穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系U87和U251，體外實(shí)驗(yàn)研究 miR-206對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-206的靶基因，并利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-206對(duì)14-3-3ζ的靶向作用。結(jié)果miR-206在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中具有較高的表達(dá)率。體外實(shí)驗(yàn)顯示，miR-206抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。靶基因預(yù)測(cè)分析14-3-3ζ為miR-206潛在的靶基因，熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)14-3-3ζ是miR-206的直接靶點(diǎn)。結(jié)論miR-206可能通過靶向14-3-3ζ抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，可能是膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。

miR-206；膠質(zhì)瘤；增殖；凋亡

miRNAs與腫瘤發(fā)生有關(guān)〔1〕。膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率大、死亡率高等特點(diǎn)〔2〕。Zhang等〔3〕報(bào)道了抑制miR-221/222基因簇的表達(dá)，能夠降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。miR-21、miR-125b、miR-181a和miR-181b等也被報(bào)道能夠影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡〔1，4〕。miR-206作為新發(fā)現(xiàn)的 miRNA 在多種腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔5〕。但是miR-206對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響尚未報(bào)道。本研究擬分析miR-206對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1臨床資料2015年1～6月在我院腫瘤科確診為膠質(zhì)瘤并且進(jìn)行手術(shù)治療的患者15例，術(shù)前均未進(jìn)行放化療。所有組織離體后直接投入液氮中貯存?zhèn)溆??；颊吣挲g60～80歲，平均65.2歲。樣品的采集均經(jīng)患者以及家屬的知情同意。

1.2細(xì)胞系、載體及試劑人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87和U251細(xì)胞系以及正常人腦膠質(zhì)細(xì)胞(HEB)均從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究購(gòu)得。青霉素、鏈霉素(Sigma公司，美國(guó))，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，Gibco BRL公司，美國(guó))，pGL3質(zhì)粒(Promega 公司，美國(guó))，Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司，美國(guó))，miR-206模擬物及對(duì)照購(gòu)自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司；Ki67、Bcl-2、Caspase-3、p-caspase-3、14-3-3ζ和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))Dual-Luciferase Reporter System(Biovision公司，美國(guó))。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株置于含10%的胎牛血清、鏈霉素 100 μg/ml、青霉素100 U/ml的RPMI1640 培養(yǎng)液中37℃，5% CO2飽和濕度貼壁培養(yǎng)。單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80% 融合時(shí)，進(jìn)行胰蛋白酶消化，然后以600 r/min 5 min離心傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期活力良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2RT-PCR檢測(cè)嚴(yán)格按照Trizol使用說明書提取組織和細(xì)胞中的總RNA，并用紫外分光光度法進(jìn)行定量。接著按照PrimeScript RT Reagent Kit使用說明，合成miR-206的cDNA，反應(yīng)條件是95℃，3 min (1個(gè)循環(huán))，95℃、12 s，61℃、40 s(38個(gè)循環(huán))。實(shí)施定量PCR的反應(yīng)按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ使用說明，反應(yīng)程序?yàn)?5℃、10 min預(yù)期變性，95℃、10 s，59℃、30 s(40個(gè)循環(huán)) 。以U6 為內(nèi)參基因，分析miR-206在不同組織和細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的U87和U251細(xì)胞，以2×105/孔的密度分別接種于6孔培養(yǎng)板中，孔中均加入不含抗生素的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%。然后按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-206模擬物對(duì)照(miR-control)和miR-206模擬物(miR-206 mimics)轉(zhuǎn)染至U87和U251細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)24 h后更換新鮮的培養(yǎng)液。

1.3.4噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)良好的U87和U251轉(zhuǎn)染miR-206模擬物的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，以3×104/孔的密度接種于96孔板后加入DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)周期4 d，每天按時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)，每孔先加入20 μl (5 g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，然后換液，每孔加入150 μl二甲亞砜，放入搖床中輕微振蕩直至完全溶解MTT轉(zhuǎn)化生成的紫色甲臜。之后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 nm處的吸光度。

1.3.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡取生長(zhǎng)良好的U87和U251轉(zhuǎn)染miR-206模擬物和模擬物對(duì)照的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，將細(xì)胞加入100 μl 1倍上樣緩沖液重懸，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)染料，避光，振蕩混勻，室溫反應(yīng)10 min。再次加入400 μl 1倍上樣緩沖液，混勻。然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.6免疫印跡提取各細(xì)胞樣本的總蛋白，定量，使用10%的分離膠電泳。冰浴下100 V轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相對(duì)應(yīng)的一抗4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，10 min/次。加入二抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌3 次，15 min/次，在暗室中進(jìn)行壓片，然后顯影、定影。

1.3.7miR-206靶基因預(yù)測(cè)MICROCOSM，TargetScan和PicTar 3個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-206的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.8熒光素酶實(shí)驗(yàn)將14-3-3ζ 3′UTR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGL3質(zhì)粒Xbal酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pGL3-WT-14-3-3ζ(野生型)報(bào)告基因質(zhì)粒。通過GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System 試劑盒，突變14-3-3ζ 3′UTR 序列內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建pGL3-MUT-14-3-3ζ真核表達(dá)載體(突變型)。取U251細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染為以下幾組，①14-3-3ζ 野生型質(zhì)粒：對(duì)照組(轉(zhuǎn)染野生型14-3-3ζ質(zhì)粒和miR-206模擬物對(duì)照)、實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染野生型14-3-3ζ質(zhì)粒和miR-206模擬物)。②14-3-3ζ突變型質(zhì)粒：對(duì)照組(轉(zhuǎn)染突變型14-3-3ζ質(zhì)粒與miR-206模擬物對(duì)照)、實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染突變型14-3-3ζ質(zhì)粒與miR-206模擬物)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，采用Dual-Luciferase Reporter System，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1miR-206在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，miR-206在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平(0.38±0.05)顯著低于正常人腦組織(設(shè)為1)(P<0.05)。在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87和U251細(xì)胞系中的表達(dá)水平(0.40±0.04，0.48±0.06)也顯著低于HEB(P<0.05)。

2.2外源性增加miR-206抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染miR-206的U87和U251細(xì)胞的增殖速度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-206的U87和U251細(xì)胞中Ki67蛋白的表達(dá)水平(0.42±0.05、0.33±0.04)顯著低于對(duì)照組(設(shè)為1)(P<0.05)。見圖1。

圖1　U87和U251中miR-206上調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.3外源性增加miR-206促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染miR-206的U87和U251細(xì)胞的凋亡率〔(21.32±2.15)%,(16.58±2.64)%〕明顯高于對(duì)照組〔(2.87±0.89)%,(3.27±1.08)%〕(P<0.05)，表明外源性增miR-206促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染miR-206的U87和U251細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平(0.28±0.04,0.33±0.05)相比于對(duì)照組(設(shè)為1)明顯降低，Caspase-3的表達(dá)水平(0.92±0.08,1.05±0.09)沒有明顯變化，而p-Caspase-3的表達(dá)水平(2.15±0.25,19.8±0.21)則出現(xiàn)了顯著的升高，這也表明了外源性增加miR-206促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。見圖2。

圖2　U87和U251中miR-206上調(diào)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖3　miR-206直接靶向14-3-3ζ

2.4miR-206直接作用于14-3-3ζ將MICROCOSM、TargetScan和PicTar 3個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫所得到的預(yù)測(cè)結(jié)果比對(duì)之后，選取被三者都預(yù)測(cè)得到的靶基因作為備選，進(jìn)而選得14-3-3ζ為靶基因。14-3-3ζ mRNA的3′UTR與miR-206的種子區(qū)存在理論上的互補(bǔ)匹配序列，見圖3。如圖3所示，熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示共轉(zhuǎn)染14-3-3ζ野生型的實(shí)驗(yàn)組中，熒光素酶活性(0.46±0.06)與對(duì)照組(設(shè)為1)相比明顯下降(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染MET突變型的實(shí)驗(yàn)組(0.95±0.09)與對(duì)照組(1.05±0.08)的熒光素酶活性無顯著差異，熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-206可以直接靶向14-3-3ζ。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-206的U87和U251細(xì)胞中14-3-3ζ蛋白的表達(dá)水平(0.42±0.05,0.58±0.08)顯著低于對(duì)照組(設(shè)為1)(P<0.05)。

3　討　論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的46%，其預(yù)后差，即使行聯(lián)合手術(shù)、放化療等，病人的平均生存期也僅為診斷后的9～12個(gè)月〔6〕。膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程。miRNA調(diào)控人體60%的蛋白編碼基因〔7〕。Xia等〔4〕報(bào)道了miR-125通過靶向Bmf影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。Shi等〔1〕報(bào)道了hsa-miR-181a和hsa-mir-181b能夠抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生。Zhang等〔3〕證實(shí)了抑制miR-221/222基因簇的表達(dá)，降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。miR-206已經(jīng)被報(bào)道與腫瘤的發(fā)生有關(guān)〔5〕。Wang等〔8〕報(bào)到了miR-206能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和凋亡。但是關(guān)于miR-206對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是否有影響，目前尚未有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-206在膠質(zhì)瘤組織和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87和U251細(xì)胞系中有一個(gè)較高的表達(dá)水平。體外研究也發(fā)現(xiàn)外源性增加miR-206抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。

14-3-3ζ蛋白在多種癌癥中過表達(dá)，包括腦腫瘤，被普遍認(rèn)為是癌癥發(fā)生的一個(gè)致癌基因〔9～11〕。14-3-3ζ存在于多種組織、器官中，例如腎上腺、腸、肝等，尤其在腦中的含量較為豐富，主要位于神經(jīng)源性成分中，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后都有一定的關(guān)系〔12〕。本研究推測(cè)miR-206可能通過靶向14-3-3ζ抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。

膠質(zhì)瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程。miR-206的功能分析顯示其能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，而且能夠直接靶向與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后都有一定關(guān)系的14-3-3ζ蛋白。這為以后深入研究miR-206-14-3-3ζ對(duì)膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性的影響奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后研究膠質(zhì)瘤的診斷、治療以及預(yù)后提供了新靶點(diǎn)。

1Shi L，Cheng Z，Zhang J，etal.hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors in human glioma cells〔J〕.Brain Res,2008；1236(2)：185-93.

2Hwang JH，Smith CA，Salhia B，etal.The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells〔J〕.Neoplasia,2008；10(2)：149-59.

3Zhang C，Kang C，You Y，etal.Co-suppression of miR-221/222 cluster suppresses human glioma cell growth by targeting p27kip1 in vitro and in vivo〔J〕.Int J Oncol,2009；34(6)：1653-60.

4Xia HF，He TZ，Liu CM，etal.MiR-125b expression affects the proliferation and apoptosis of human glioma cells by targeting Bmf〔J〕.Cell Physiol Biochem，2009；23(4-6)：347-58.

5Zhang L，Xia L，Zhao L，etal.Activation of PAX3-MET pathways due to miR-206 loss promotes gastric cancer metastasis〔J〕.Carcinogenesis,2015;36(3):390-9.

6趙學(xué)英.RNAi沉默Livin基因?qū)β闶笠浦擦錾L(zhǎng)及Ki67蛋白表達(dá)的影響〔J〕.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015；14(5)：352-5.

7葉振南，徐善水.miRNA 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)及作用〔J〕.山東醫(yī)藥，2013；53(33)：100-2.

8Wang R，Hu Y，Song G，etal.MiR-206 regulates neural cells proliferation and apoptosis via Otx2〔J〕.Cell Physiol Biochem,2012；29(3-4)：381-90.

9Friedman RC，F(xiàn)arh KK，Burge CB，etal.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs〔J〕.Genome Res,2009；19(1)：92-105.

10Ralhan R，Masui O，DeSouza LV，etal.Identification of proteins secreted by head and neck cancer cell lines using LC-MS/MS：strategy for discovery of candidate serological biomarkers〔J〕.Proteomics,2011；11(12)：2363-76.

11Ko BS，Lai IR，Chang TC，etal.Involvement of 14-3-3γ overexpression in extrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Hum Pathol,2011；42(1)：129-35.

12Yan Y，Xu Y，Gao YY，etal.Implication of 14-3-3ε and 14-3-3θ/τ in proteasome inhibition-induced apoptosis of glioma cells〔J〕.Cancer Sci,2013；104(1)：55-61.

〔2016-03-24修回〕

(編輯袁左鳴)

河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.112102310173)

張保朝(1963-)，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科疾病研究。

周靜(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事膠質(zhì)瘤的研究。

R739.41

A

1005-9202(2016)15-3739-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.060

1南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科