吳曉波　曹亞麗　劉秋明　陳　軍　胡平華　周　平　丁景弦

(南昌市第三醫(yī)院乳腺中心，江西　南昌　330009)

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老年乳腺癌患者癌組織中FoxP3蛋白的檢測意義

吳曉波曹亞麗劉秋明陳軍胡平華周平丁景弦

(南昌市第三醫(yī)院乳腺中心，江西南昌330009)

目的探析老年婦女乳腺癌及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(FoxP)3蛋白的表達水平及其臨床意義。方法免疫組化EnVision兩步染色法檢測56例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌老年女性患者腋下轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的FoxP3的表達水平，比較癌組織及癌旁組織內(nèi)、原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)FoxP3表達及FoxP3+淋巴細胞，分析臨床病理特征與FoxP3表達及FoxP3+淋巴細胞的關(guān)系。結(jié)果癌組織及癌旁組織內(nèi)FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均有顯著差異(P<0.01)，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均有顯著差異(P<0.01)。組織學(xué)分級、直徑與FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均無關(guān)(P>0.05)，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)及Her2與FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均相關(guān)(P<0.01)。孕激素受體(PR)與FoxP3表達水平無關(guān)(P>0.05)，卻與FoxP3+淋巴細胞表達水平相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論乳腺浸潤性導(dǎo)管癌老年女性患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與FoxP3蛋白、FoxP3+淋巴細胞相關(guān)，對FoxP3蛋白進行抑制有助于發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的治療。

叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3；乳腺癌；浸潤性導(dǎo)管癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

乳腺癌特別是浸潤性導(dǎo)管癌作為一種惡性腫瘤，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移則預(yù)后較差，療效往往不夠理想〔1〕。調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)與乳腺癌關(guān)系密切；叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(FoxP)3是Treg的一個特異性標記，其作為轉(zhuǎn)錄因子也發(fā)揮著不可替代的作用〔2〕。本文旨在通過對老年乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及浸潤性導(dǎo)管癌中FoxP3蛋白水平的檢測，探析其臨床價值。

1　資料與方法

1.1一般資料2013年4月至2015年1月在我院接受治療的56例老年乳腺癌患者的臨床資料，癌組織制成蠟塊標本，經(jīng)病理切片確診為浸潤性導(dǎo)管癌，嚴格依據(jù)2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于乳腺癌的相關(guān)分類標準〔3〕，且腋下的淋巴結(jié)檢出數(shù)目至少為15枚作為此次的診斷標準，均為女性，年齡≥60歲，其中伴發(fā)腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例。

1.2研究方法主要試劑：福州邁新生物技術(shù)公司生產(chǎn)的pH6.0檸檬酸緩沖修復(fù)液和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗，Santa Cruz公司生產(chǎn)的1∶50稀釋過的鼠抗人FoxP3單克隆抗體。

1.3免疫組化EnVision兩步染色法嚴格參照試劑盒所規(guī)定的步驟實施操作：切片、脫水；于3%雙氧水中浸泡3 min后，抗原熱修復(fù)30 min；將一抗滴入其中，于4℃下過夜；滴加二抗，30 min后進行顯色反應(yīng)。期間每個步驟均經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，復(fù)染后封片。陽性對照：試劑盒內(nèi)的陽性圖片；陰性對照：PBS替代一抗。

1.4結(jié)果判定FoxP3主要出現(xiàn)在癌細胞核或細胞質(zhì)及Treg細胞核上，棕黃色顆粒的出現(xiàn)定義為陽性。行半定量分析。切片均取高倍視野10個進行陽性評分。按染色百分比與染色強度分別對癌細胞進行評分：染色百分比超過75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，5%～25%為1分，低于5%為0分；染色強度：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分；無染色為0分。上述兩者的分數(shù)和超過6分為高表達；不超過6分則為低表達。FoxP3+淋巴細胞評分：視野超過3個，每個視野的陽性細胞數(shù)超過3個，3分；視野超過3個，每個視野的陽性細胞為1～3個，2分；視野不超過3個，每個視野的陽性細胞為1～3個，1分；沒有陽性細胞則為0分。2、3分為高表達；0、1分為低表達。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和χ2檢驗。

2　結(jié)　果

2.1FoxP3表達癌組織及癌旁組織內(nèi)FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均有顯著差異(P<0.01)，見表1。

表1　癌組織及癌旁組織內(nèi)FoxP3表達的比較(n,n=56)

2.2原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)FoxP3表達原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均有顯著差異(P<0.01)。見表2。

表2　原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)FoxP3表達的比較(n,n=22)

2.3臨床病理特征與FoxP3表達的關(guān)系組織學(xué)分級、直徑與FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均無關(guān)(P>0.05)，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)及Her2與FoxP3、FoxP3+淋巴細胞表達水平均相關(guān)(P<0.01)。孕激素受體(PR)與FoxP3表達水平無關(guān)(P>0.05)，卻與FoxP3+淋巴細胞表達水平相關(guān)(P<0.01)。見表3。

表3　臨床病理特征與FoxP3表達的關(guān)系(n)

3　討　論

FoxP3和調(diào)節(jié)性Treg的分化與功能關(guān)系密切，大量的研究資料顯示Treg在抑制腫瘤免疫中扮演了重要的角色〔4〕。Treg存在于各種惡性腫瘤內(nèi)，許多學(xué)者認為乳腺癌患者的預(yù)后與癌組織內(nèi)的Treg息息相關(guān)〔5〕。Treg的亞群有γδ-黃胸鼠肺成纖維細胞(YCR)、CD8+Treg細胞及CD4+Treg細胞，其中CD4+Treg細胞的亞群有CD4+FoxP3-富含甘油三酯脂蛋白(Trl)細胞、抗原誘導(dǎo)及自然分化的CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞〔6〕。乳腺癌患者體內(nèi)FoxP3+Treg數(shù)目的增加通常被認作是乳腺癌惡化的體現(xiàn)，且被看作腫瘤進展的一個重要指標。大量因子可以間接或直接參與Treg反應(yīng)，Treg最為重要的一種作用機制是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)通路，在腫瘤發(fā)展特別是轉(zhuǎn)移期間對腫瘤細胞擴散能力產(chǎn)生了極大影響〔7〕。Treg表達受體CCR4被其配體CCL22、CCL17及CCL5等吸引而匯集至腫瘤區(qū)域，激活后產(chǎn)生大量的TGF-β因子，該因子依靠各種途徑使腫瘤進展加速，此外Treg還會與部分癌基因互相作用，然而具體的作用機制目前還未確定。

研究顯示，F(xiàn)oxP3是X染色體的一種抑制基因，主要在各種惡性腫瘤如腸癌、肺癌、乳腺癌等癌細胞內(nèi)表達，其在乳腺癌患者癌細胞內(nèi)的表達FoxP3與此類患者的預(yù)后關(guān)系密切，特別是在淋巴轉(zhuǎn)移患者中〔8〕。FoxP3屬于轉(zhuǎn)錄因子，對癌細胞生長有著多種作用的影響，最新的研究發(fā)現(xiàn)FoxP3轉(zhuǎn)錄抑制乳腺癌癌基因Her2和SKP2。雖然FoxP3一般與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)〔9〕，但是近期的研究結(jié)果顯示乳腺癌患者中，Her2過表達的亞型內(nèi)的FoxP3陽性表達與其良好的預(yù)后有關(guān)，其作用機制也許是通過對乳腺癌Her2轉(zhuǎn)錄表達進行抑制，達到抑制Her2的目的，對癌細胞生長進行抑制來調(diào)節(jié)乳腺癌，說明腫瘤自身的特征是FoxP3蛋白發(fā)揮作用的重要基礎(chǔ)〔10〕。

目前尚未明確FoxP3對乳腺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移的促進機制，推測可能有兩個方面：FoxP3+淋巴細胞發(fā)揮著免疫抑制的重要作用，可以通過細胞間的直接接觸或者是通過產(chǎn)生部分炎癥調(diào)節(jié)因子進行間接調(diào)節(jié)，Treg上升抑制了機體產(chǎn)生抗瘤免疫，加速了癌組織免疫逃逸，進而使轉(zhuǎn)移較容易產(chǎn)生；此外，癌組織內(nèi)的FoxP3表達可以與癌細胞表達的受體CXCR4和CCR7連接，上調(diào)其表達及轉(zhuǎn)錄，促進其轉(zhuǎn)移和浸潤〔11〕。

本研究結(jié)果提示FoxP3蛋白是惡性腫瘤的標記；轉(zhuǎn)移灶內(nèi)組織存在局部免疫狀態(tài)變化，F(xiàn)oxP3與浸潤性導(dǎo)管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能相關(guān)，可以看作發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的老年乳腺浸潤性導(dǎo)管癌女性患者的一個治療靶點，此外在靶向治療的同時應(yīng)該盡量考慮轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶間的差異，選擇適當?shù)姆呕熤委煼桨?。本研究提示FoxP3蛋白與多種臨床病理特征相關(guān)。但是尚不能將FoxP3作為唯一指標去判斷其是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1Jing Y，Bejarano MT，Zaias J，etal.In vivo anti-metastatic effects of uPAR retargeted measles virus in syngeneic and xenograft models of mammary cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2015；149(1)：99-108.

2Woo S，Lee BL，Yoon J，etal.Constitutive activation of signal transducers and activators of transcription 3 correlates with better prognosis，cell proliferation and hypoxia-inducible factor-1alpha in human gastric cancer〔J〕.Pathobiology，2011；78(6)：295-301.

3Morales-Sanchez A，Molina-Munoz T，Martinez-Lopez JL，etal.No association between epstein-barr virus and mouse mammary tumor virus with breast cancer in Mexican women〔J〕.Sci Rep，2013；3：2970.

4Li J，Jiang X.Loss of runt-related transcription factor 3 expression associated with human hepatocellular carcinoma progression and prognosis〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2011；12(9)：2285-90.

5Hertel J，Hirche C，Wissmann C，etal.Transcription of the vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR3) gene is regulated by the zinc finger proteins Sp1 and Sp3 and is under epigenetic control：transcription of vascular endothelial growth factor receptor 3〔J〕.Cell Oncol (Dordr)，2014；37(2)：131-45.

6Mason AL，Gilady SY，Mackey JR.Mouse mammary tumor virus in human breast cancer red herring or smoking gun〔J〕?Am J Pathol，2011；179(4)：1588-90.

7Naushad W，Bin RT，Gomez MK，etal.Detection and identification of mouse mammary tumor virus-like DNA sequences in blood and breast tissues of breast cancer patients〔J〕.Tumour Biol，2014；35(8)：8077-86.

8Motamedifar M，Saki M，Ghaderi A.Lack of association of mouse mammary tumor virus-like sequences in Iranian breast cancer patients〔J〕.Med Princ Pract，2012；21(3)：244-8.

9Tabriz HM，Zendehdel K，Shahsiah R，etal.Lack of detection of the mouse mammary tumor-like virus (MMTV) Env gene in Iranian women breast cancer using real time PCR〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2013；14(5)：2945-8.

10Baltzell K，Buehring GC，Krishnamurthy S，etal.Epstein-Barr virus is seldom found in mammary epithelium of breast cancer tissue using in situ molecular methods〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2012；132(1)：267-74.

11Pond AC，Herschkowitz JI，Schwertfeger KL，etal.Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer〔J〕.Cancer Res，2010；70(12)：4868-79.

〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)

江西省科學(xué)技術(shù)廳項目(No.20121BB070034)

吳曉波(1972-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事乳腺癌手術(shù)、化療研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)15-3727-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.054