王　鑫　王忠臣　黃智勇

(大慶龍南醫(yī)院普外科，黑龍江　大慶　163000)

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外源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因?qū)夏甏笫蠊└稳毖俟嘧p傷的影響

王鑫王忠臣黃智勇

(大慶龍南醫(yī)院普外科，黑龍江大慶163000)

目的探討外源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因?qū)夏甏笫蠊└稳毖俟嘧p傷的影響。方法SD大鼠分為端粒酶催化亞基(hTERT)干預(yù)組(n=25)、空轉(zhuǎn)載體組(n=5)、生理鹽水組(n=25)3組，取肝前2 d自頸背給予hTERT干預(yù)組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml攜帶hTERT的病毒懸液，給予空轉(zhuǎn)載體組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml空病毒懸液，給予生理鹽水組供者靜脈注射1 ml生理鹽水。結(jié)果再灌注后3、6、12 h，1、2 d hTERT組血清谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平均顯著低于空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組(P<0.05)，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞均顯著少于空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組(P<0.05)，凋亡指數(shù)也均顯著低于空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染1 d后hTERT組肝細(xì)胞端粒酶活性顯著高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論外源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因能夠有效防護(hù)老年大鼠供肝缺血再灌注損傷。

外源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因；供肝缺血再灌注損傷

肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)的一個(gè)極為重要的表現(xiàn)就是細(xì)胞凋亡，組織產(chǎn)生的氧自由基在再灌注的情況下會(huì)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其發(fā)生凋亡〔1〕。目前國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)就是采取何種方法最大限度地降低缺血再灌注引發(fā)的移植肝細(xì)胞凋亡程度?，F(xiàn)階段，基因重組技術(shù)已經(jīng)得到了應(yīng)用，對(duì)Bcl-2、HO-1等進(jìn)行構(gòu)建表達(dá)，對(duì)凋亡基因的質(zhì)粒進(jìn)行抑制并向小動(dòng)物肝移植供者體內(nèi)導(dǎo)入，但是將目的基因設(shè)定為端粒酶的研究還沒(méi)有出現(xiàn)〔2〕。本研究對(duì)肝移植缺血再灌注損傷中人端粒酶催化亞基(hTERT)基因的作用進(jìn)行探討。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料采用黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SD大鼠，本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建表達(dá)外源性hTERT的重組復(fù)制缺陷性腺病毒，經(jīng)Pme I酶切線性化攜帶目的基因的質(zhì)粒后向細(xì)菌中轉(zhuǎn)入，并同源重組其和細(xì)菌中含腺病毒基因骨架的質(zhì)粒AdEasy。經(jīng)Pac I酶切重組質(zhì)粒Ad-hTERT后對(duì)293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，包裝成腺病毒顆粒，并大量擴(kuò)增及純化。同時(shí)將空載體病毒AdEasy質(zhì)粒構(gòu)建，擴(kuò)增、氯化銫梯度離心后對(duì)病毒滴度進(jìn)行測(cè)定，保存在-80℃的溫度下備用。購(gòu)買(mǎi)美國(guó)Allied Biotech Inc公司生產(chǎn)的端粒酶檢測(cè)試劑盒和美國(guó)Boehinger Mannheim公司生產(chǎn)的TUNEL試劑盒。

1.2實(shí)驗(yàn)分組將SD大鼠分為hTERT干預(yù)組(n=25)、空轉(zhuǎn)載體組(n=5)、生理鹽水組(n=25)3組，取肝前2 d自頸背給予hTERT干預(yù)組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml攜帶hTERT的病毒懸液，給予空轉(zhuǎn)載體組供者靜脈注射1 ml 3×109pfu/ml空病毒懸液，給予生理鹽水組供者靜脈注射1 ml生理鹽水。在肝臟保存(UW)液中放置切取的供肝，進(jìn)行6 h的修整保存后向同種大鼠移植。移植后3、6、12 h、1、2 d，分別取材對(duì)ALT、端粒酶活性等進(jìn)行檢測(cè)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法①運(yùn)用二袖套法建立大鼠肝移植模型；②抽取下腔靜脈血，取上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量進(jìn)行測(cè)定；③將20 mg目的基因轉(zhuǎn)染的供肝組織與20 mg對(duì)照組供肝組織取出，采用美國(guó)Allied Biotech Inc公司生產(chǎn)的Telomerase PCR ELISA試劑盒檢測(cè)端粒酶活性，操作過(guò)程中嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；④免疫印跡法的操作步驟為：應(yīng)用蛋白裂解液將肝組織裂解，-4℃離心將上清取出，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，將一抗、二抗加入其中，顯色；⑤采用10%甲醛溶液將肝組織固定，HE染色前保證常規(guī)石蠟切片，然后在普通光鏡及電鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察；⑥將規(guī)格為0.5 cm×0.5 cm的大鼠肝組織取出，在4%多聚甲醛中放置，進(jìn)行1 d的固定后常規(guī)石蠟包埋，切成切片，切片厚度為5 μm，操作過(guò)程中嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核被染成棕黃色，高倍視野(×400)下將每張切片的5個(gè)視野選取出來(lái)，為每個(gè)視野肝細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，同時(shí)為陽(yáng)性肝細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用軟件SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1再灌注后血清ALT水平比較再灌注后3、6、12 h hTERT組血清ALT水平均顯著低于空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組(P<0.05)，但空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組血清ALT水平差異均不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組再灌注后各時(shí)點(diǎn)血清ALT水平比較±s)

與空轉(zhuǎn)載體組比較：1)P<0.05；與生理鹽水組比較：2)P<0.05；下表同

2.2再灌注后肝細(xì)胞端粒酶活性比較轉(zhuǎn)染1 d后hTERT組肝細(xì)胞端粒酶活性(32 500±500)顯著高于陰性對(duì)照組(22 500±500)和陽(yáng)性對(duì)照組(2 500±500)(P<0.05)。

2.3免疫印跡檢測(cè)結(jié)果有顯著hTERT蛋白陽(yáng)性條帶存在于hTERT組肝組織中，但是不存在于空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組。見(jiàn)圖1。

2.4移植肝臟組織學(xué)檢查結(jié)果空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組移植肝小梁結(jié)構(gòu)均被嚴(yán)重破壞，有空泡樣變性及水腫出現(xiàn)在門(mén)靜脈周?chē)?，電鏡檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)有大量空泡出現(xiàn)在肝細(xì)胞內(nèi)，線粒體腫脹嚴(yán)重。見(jiàn)圖2。

2.5肝細(xì)胞凋亡檢查結(jié)果再灌注后3、6、12 h，1、2 d hTERT組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞均顯著少于空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組(P<0.05)，凋亡指數(shù)也均顯著低于空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組(P<0.05)，但空轉(zhuǎn)載體組和生理鹽水組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞和凋亡指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖3。

圖1　各組肝組織中hTERT蛋白的表達(dá)情況

組別n3h6h12h1d2dhTERT組255.3±0.731)2)10.2±0.671)2)9.3±0.781)2)7.1±1.121)2)4.8±0.651)2)空轉(zhuǎn)載體組57.8±1.0515.9±1.8211.7±1.598.3±1.096.4±0.67生理鹽水組257.8±0.8315.9±1.5811.7±1.598.8±0.86.5±0.70

圖2　移植肝臟組織學(xué)檢查結(jié)果(×100)

圖3　再灌注后hTERT組、生理鹽水組肝細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞(×200)

3　討　論

在臨床病理及手術(shù)過(guò)程中，肝臟缺血再灌注損傷極易發(fā)生，其屬于一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，參與主體為多細(xì)胞，多種介質(zhì)共同將作用發(fā)揮出來(lái)。細(xì)胞凋亡即細(xì)胞死亡，誘發(fā)因素為生理性等因素，不引發(fā)炎癥反應(yīng)。很多疾病的發(fā)生過(guò)程均受到凋亡異常的直接影響。研究表明〔3〕，細(xì)胞凋亡和缺血再灌注損傷具有極為密切的關(guān)系，在HIRI的病理過(guò)程中，凋亡可能發(fā)揮著極為重要的作用。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者研究表明〔4〕，向大腦皮層轉(zhuǎn)染缺陷型單純皰疹病毒載體(載有抗凋亡基因bcl-2)后bcl-2基因表達(dá)顯著，同時(shí)能夠有效保護(hù)表達(dá)部位神經(jīng)?，F(xiàn)階段，已有相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者在對(duì)大鼠等bcl-2高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行建立的過(guò)程中將轉(zhuǎn)基因技術(shù)充分利用，同時(shí)在缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型的建立過(guò)程中將該動(dòng)物充分利用，研究結(jié)果顯示和正常動(dòng)物相比，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有顯著較強(qiáng)的組織損傷程度〔5〕。研究證實(shí)〔6〕，衰老進(jìn)程由端粒長(zhǎng)度控制，對(duì)衰老進(jìn)行觸發(fā)的分子鐘為端?？s短。在大部分正常的人體細(xì)胞中并無(wú)法對(duì)端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)，隨著細(xì)胞分裂，端粒會(huì)丟失，丟失頻率為每次50～200個(gè)堿基。研究表明〔7〕，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因?yàn)檎５娜梭w細(xì)胞中端粒酶沒(méi)有被活化。正常體細(xì)胞的增殖能力可能在保護(hù)性端粒酶的作用下受到了最終制約。細(xì)胞在幾千個(gè)堿基的端粒DNA丟失后就會(huì)停止分裂而衰老，并最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。如果體外給予適量端粒酶，則會(huì)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行有效防止，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖能力的顯著增強(qiáng)。研究表明〔8〕，向正常的細(xì)胞中導(dǎo)入端粒酶基因會(huì)造成端粒酶表達(dá)異常。異常延長(zhǎng)的活化端粒酶序列會(huì)在極大程度上增加細(xì)胞壽命。本研究結(jié)果提示外源端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因能夠有效防護(hù)老年大鼠供肝缺血再灌注損傷。

1吳靈芝，李水彬，程剛衛(wèi)，等.hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)人神經(jīng)元活力的影響〔J〕.贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014；34(2)：170-3.

2靳斌，王偉，劉澤陽(yáng)，等.外源hTERT基因轉(zhuǎn)染對(duì)老年大鼠供肝缺血再灌注損傷的防護(hù)作用〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013；51(8)：13-6.

3劉曉麗，馬禮鴻，王凱.Bmi-1和hTERT在胃癌組織中的表達(dá)及臨床病理意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(19)：4694-5.

4李金丫，左靜，劉亮，等.食管癌高發(fā)區(qū)人群咬檢組織中hTERT蛋白的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012；32(4)：713-4.

5Guo L，Li P，Meng CY，etal.Protective effect of zinc on mouse renal ischemia-reperfusion Injury by anti-apoptosis and antioxidation〔J〕.Curr Pharmac Biotechnol，2014；15(6)：577-82.

6Chahine N，Makhlouf H，Duca L，etal.Cardioprotective effect of saffron extracts against acute doxorubicin toxicity in isolated rabbit hearts submitted to ischemia-reperfusion injury〔J〕.Zeitschriftfür Naturforschung C，2015;69(9-10)：459-70.

7Alhejily W，Aleksi A，Martin BJ，etal.The effect of ischemia-reperfusion injury on measures of vascular function〔J〕.Clin Hemorheol Microcirc，2014L；56(3)：265-71.

8Zhu SH，Zhou LJ，Jiang H，etal.Protective effect of indomethacin in renal ischemia-reperfusion injury in mice〔J〕.J Zhejiang Univ Sci B，2014；15(8)：735-42.

〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

王鑫(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事普外科疾病研究。

R53.3

A

1005-9202(2016)15-3660-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.022