幸仁忠，　劉建軍，　許　華△，　楊細(xì)飛△

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632； 2深圳市疾病預(yù)防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點實驗室, 廣東 深圳 518055)

?

TRPC1缺失對小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞生存的影響*

幸仁忠1，劉建軍2，許華1△，楊細(xì)飛2△

(1暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2深圳市疾病預(yù)防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點實驗室, 廣東 深圳 518055)

目的：研究瞬時受體電位通道1(TRPC1)缺失對小鼠海馬神經(jīng)元生存的影響。方法: 選用6月齡TRPC1基因敲除小鼠及其對照小鼠，通過神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN免疫染色、尼氏染色及TUNEL染色檢測TRPC1敲除小鼠海馬CA1、CA3及齒狀回(DG)神經(jīng)細(xì)胞的變化情況。通過Western blot檢測TRPC1基因敲除小鼠促凋亡因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果: NeuN免疫熒光和尼氏染色發(fā)現(xiàn)，TRPC1基因敲除小鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞顯著減少;TUNEL染色檢測發(fā)現(xiàn)TRPC1基因敲除小鼠以上區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加；Western blot結(jié)果顯示，與對照小鼠相比，TRPC1基因敲除小鼠海馬組織CHOP及cleaved caspase-3的水平均顯著升高。結(jié)論:TRPC1基因缺失可導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，其機制可能與TRPC1缺失促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

瞬時受體電位通道1； 神經(jīng)元； C/EBP同源蛋白； Caspase-3

瞬時受體電位蛋白(transient receptor potential，TRP)是一跨膜蛋白，根據(jù)氨基酸序列的同源性和功能傾向性不同，可分為TRPC、TRPV、 TRPM、TRPP、 TRPML和TRPA 6種蛋白家族。TRPC即經(jīng)典的TRP通道，TRPC 亞家族包括7個亞型(TRPC1～TRPC7)[1]，TRPC1是第1個在哺乳動物發(fā)現(xiàn)的TRP。TRPC1在腦、骨骼肌、心臟、腎臟、皮膚、睪丸、卵巢、前列腺和肺都檢測到其高表達(dá)[2]。

TRPC1是一種非選擇性陽離子通道，其主要功能是維持體內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)[3]。盡管TRPC1缺陷小鼠可以生存到成年，但很多器官和組織發(fā)生缺陷，如心腦血管、中樞神經(jīng)、骨骼、肌肉和免疫系統(tǒng)。細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。TRPC1敲除誘導(dǎo)細(xì)胞周期停留在G0/G1期[4]。TRPC1可以促進(jìn)神經(jīng)元突觸的生長，對神經(jīng)元有保護(hù)作用[5]。TRPC1與很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如帕金森病和神經(jīng)源性炎癥[6-7]。TRPC1蛋白分布于哺乳動物顳葉結(jié)構(gòu)，且神經(jīng)元選擇性地表達(dá)TRPC1，表明其可能有助于神經(jīng)元存活[8]。然而，TRPC1缺失是否影響小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞存活尚未見報道。本研究通過多種方法對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色，并檢測促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和cleaved caspase-3的表達(dá)水平來研究TRPC1缺失對小鼠神經(jīng)細(xì)胞生存的影響。

材　料　和　方　法

6月齡野生對照(129SvEv)小鼠及TRPC1基因敲除小鼠(Trpc1-/-小鼠)，野生對照小鼠從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買，Trpc1-/-小鼠由美國國家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究院Lutz Birnbaumer教授饋贈。

2主要試劑與儀器

神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN、CHOP、cleaved caspase-3 I抗均購自CST；β-actin I抗購自Santa Cruz；引物購自生工生物工程股份有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix和 SYBR? Premix Ex TaqTM購自TaKaRa；尼氏染色液購自碧云天公司；DeadEndTMFluorometric TUNEL System購自Promega；激光共聚焦顯微鏡為Leica TCS SP5；普通顯微鏡為Olympus BX60；熒光顯微鏡為Olympus ⅠX 51。

3主要方法

3.1免疫熒光用3%的水合氯醛麻醉小鼠，心臟灌注后于4%多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖中脫水48 h直到組織沉到底部，OCT包埋后于切片機中切片(15 μm)。冰凍切片于0.3% Triton X-100室溫孵育15 min，3% BSA封閉30 min，Ⅰ抗中過夜，Ⅱ抗孵育1 h，DAPI室溫孵育后加抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察和采集圖片，用Image J軟件統(tǒng)計陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

3.2尼氏染色冰凍切片于蒸餾水中漂洗2 min，尼氏染色液染色10 min,染色溫度為50 ℃。蒸餾水洗滌2次，95%乙醇中分色20 s，無水乙醇脫水10 min，二甲苯透明后用中性樹脂封片。在普通顯微鏡Olympus BX60下觀察組織。

3.3TUNEL染色石蠟切片，56℃烘箱中放置1 h熔蠟，二甲苯脫蠟5 min 3次，乙醇梯度脫水，用蛋白酶K通透組織切片，加平衡緩沖液后蓋上塑料蓋玻片，加入孵育緩沖液(內(nèi)含平衡緩沖液，核苷混合物和rTdT酶)，蓋上塑料蓋玻片，并于37°C孵育1 h，避免光照。移除塑料蓋玻片，將載玻片浸入2×SSC，1×PBS洗5 min 3次后加DAPI，抗熒光淬滅劑封片后，用熒光顯微鏡在藍(lán)光下檢測定位凋亡細(xì)胞的綠色熒光(熒光素-12-dUTP)。

3.4Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白取25 μg 蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，Ⅰ抗中4 ℃過夜，TBST漂洗PVDF 膜10 min 3次，取出PVDF膜加入Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠Ⅱ抗1∶3 000， 羊抗兔Ⅱ抗1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜后曝光。

為測試用戶操作軟件的性能，在泳池環(huán)境下進(jìn)行測試。圖5是泳池環(huán)境下的ROV，圖6是自動檢測界面，圖7是主操作界面。

4統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用Graph Pad Prism 6.0軟件對組間差異進(jìn)行t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1TRPC1缺失導(dǎo)致海馬NeuN陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少

免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，Trpc1-/-小鼠CA1、CA3和齒狀回(dentate gyrus, DG)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較野生型小鼠顯著減少(P<0.05)，見圖1。

2TRPC1缺失誘導(dǎo)神經(jīng)元顯著減少

居氏染色結(jié)果提示：和野生型小鼠相比，Trpc1-/-小鼠的CA1、CA3和DG區(qū)的神經(jīng)元減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

3TRPC1缺失誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加

為了確定TRPC1缺失是否誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，我們對小鼠海馬進(jìn)行TUNEL染色。藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核，綠色熒光代表凋亡細(xì)胞，統(tǒng)計結(jié)果顯示，Trpc1-/-小鼠的CA1、CA3和DG區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05),見圖3。

4TRPC1缺失誘導(dǎo)凋亡蛋白活化

促凋亡蛋白CHOP和凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3在Trpc1-/-小鼠海馬中的水平顯著增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 1.TRPC1 depletion causes neuronal loss. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

圖1NeuN染色檢測神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量

Figure 2.TRPC1 depletion reduced the number of neurons. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

圖2尼氏染色檢測神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量

Figure 3.The effects of TRPC1 depletion on apoptosis in hippocampus. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWT.

圖3TUNEL染色檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化

Figure 4.The effects of TRPC1 depletion on the levels of CHOP and cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsWT.

圖4Western blot分析促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3水平

討　　論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是儲存Ca2+的重要細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)起重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)主要受2方面的影響：Ca2+誘發(fā)性鈣釋放 (calcium-induced calcium release, CICR)和鈣庫操縱性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)。CICR誘導(dǎo)Ca2+從鈣庫釋放到胞漿；細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平發(fā)生變化時，尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的濃度下降時，間質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)被激活并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，與TRPC1結(jié)合激活鈣庫操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels, SOCC)，產(chǎn)生SOCE促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，從而增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的濃度[9-10]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的失衡是誘發(fā)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的刺激因子。Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機制有：(1)調(diào)節(jié)線粒體滲透性而參與細(xì)胞凋亡[11]，激活哺乳動物線粒體的膜通道PTP，使得相對分子量低的分子通透性突然增大，釋放一些小分子如細(xì)胞色素C、Ca2+、凋亡誘導(dǎo)因子等，這些物質(zhì)可以直接或間接引起細(xì)胞凋亡;(2)Ca2+可調(diào)節(jié)磷脂酶活性，磷脂酶的激活與Ca2+啟動的細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理條件下遵循自己的生命程序，自己結(jié)束生命的過程，最后細(xì)胞脫落離體或裂解成若干凋亡小體被其它細(xì)胞吞噬[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TRPC1基因敲除小鼠的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較野生型小鼠顯著減少，促凋亡蛋白CHOP和激活的caspase-3水平均顯著升高，提示TRPC1缺失可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。TRPC1敲除可直接或間接破壞線粒體，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+消耗和激活未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response, UPR)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+消耗導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+平衡被破壞，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13]。UPR的活化可幫助機體抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，但持續(xù)性的未折疊蛋白應(yīng)答導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理機制不能恢復(fù)正常，最終觸發(fā)細(xì)胞程序性死亡[14]。Casapse-3是執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵分子之一，通過蛋白酶解加工分解成有活性的片段p12和p17。研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，促凋亡蛋白CHOP的表達(dá)水平增加并介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[15]。因此TRPC1缺失導(dǎo)致小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞丟失可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致促凋亡蛋白CHOP的表達(dá)水平增加導(dǎo)致的。

綜上所述，本研究通過多種染色方法證實TRPC1缺失可導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞丟失，其機制可能是由于TRPC1缺失，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣紊亂，激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起促凋亡因子CHOP表達(dá)上調(diào)及凋亡蛋白caspase-3激活，最終使神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

[1]Tominaga M, Takayama Y. Interaction between TRP and Ca2+-activated chloride channels[J]. Channels (Austin), 2014, 8(3):178-179.

[2]Ramsey IS, Delling M, Clapham DE. An introduction to TRP channels[J]. Annu Rev Physiol, 2006, 68:619-647.

[3]Bandyopadhyay BC, Ong HL, Lockwich TP, et al. TRPC3 controls agonist-stimulated intracellular Ca2+release by mediating the interaction between inositol 1,4,5-trisphosphate receptor and RACK1[J]. J Biol Chem, 2008, 283(47):32821-32830.

[4]Li M, Chen C, Zhou Z, et al. A TRPC1-mediated increase in store-operated Ca2+entry is required for the proliferation of adult hippocampal neural progenitor cells[J]. Cell Calcium, 2012, 51(6):486-496.

[5]Heo DK, Chung WY, Park HW, et al. Opposite regulatory effects of TRPC1 and TRPC5 on neurite outgrowth in PC12 cells[J]. Cell Signal, 2012, 24(4):899-906.

[6]Bollimuntha S, Singh BB, Shavali S, et al. TRPC1-mediated inhibition of 1-methyl-4-phenylpyridinium ion neurotoxicity in human SH-SY5Y neuroblastoma cells[J]. J Biol Chem, 2005,280(3):2132-2140.

[7]Bollimuntha S, Ebadi M, Singh BB. TRPC1 protects human SH-SY5Y cells against salsolinol-induced cytotoxicity by inhibiting apoptosis[J]. Brain Res, 2006, 1099(1):141-149.

[8]von Bohlen UHO, Hinz U, Unsicker K, et al. Distribution of TRPC1 and TRPC5 in medial temporal lobe structures of mice[J]. Cell Tissue Res, 2005, 322(2):201-206.

[9]Smyth JT, Hwang SY, Tomita T, et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry[J]. J Cell Mol Med, 2010, 14(10):2337-2349.

[10]Zhang SL, Yu Y, Roos J, et al. STIM1 is a Ca2+sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+store to the plasma membrane[J]. Nature, 2005, 437(7060):902-905.

[11]Biral D, Jakubiec-Puka A, Ciechomska I, et al. Loss of dystrophin and some dystrophin-associated proteins with concomitant signs of apoptosis in rat leg muscle overworked in extension[J]. Acta Neuropathol, 2000, 100(6):618-626.

[12]彭黎明,王曾禮.細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)與臨床[M].第1版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2000:7.

[13]Selvaraj S, Sun Y, Watt JA, et al. Neurotoxin-induced ER stress in mouse dopaminergic neurons involves downregulation of TRPC1 and inhibition of AKT/mTOR signaling[J]. J Clin Invest, 2012, 122(4):1354-1367.

[14]Harding HP, Calfon M, Urano F, et al. Transcriptional and translational control in the Mammalian unfolded protein response[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2002, 18:575-599.

[15]Barone MV, Crozat A, Tabaee A, et al. CHOP (GADD153) and its oncogenic variant, TLS-CHOP, have opposing effects on the induction of G1/S arrest[J]. Genes Dev, 1994, 8(4):453-464.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effect of TRPC1 depletion on survival of cerebral nerve cells

XING Ren-zhong1, LIU Jian-jun2, XU Hua1, YANG Xi-fei2

(1CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2KeyLaboratoryofModernToxicologyofShenzhen,ShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518055,China.E-mail:huax_mail@126.com;E-mail:xifeiyang@gmail.com)

AIM: To study the effect of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) on the survival of hippocampal neurons in mice.METHODS:TRPC1 knockout mice and the control mice (6 months old) were used in this study. Immunofluorescence staining of neuron-specific marker NeuN, Nissl staining and TUNEL staining were performed to measure the changes of the neurons in hippocampal CA1, CA3 and dentate gyrus (DG). Western blot analysis was used to detect the levels of pro-apoptotic protein C/EBP homologous protein (CHOP) and cleaved caspase-3.RESULTS: Immunofluorescence staining and Nissl staining showed that the number of neuronal cells was significantly decreased in hippocampal CA1, CA3 and DG ofTRPC1 knockout mice compared with the control mice. TUNEL staining showed that the apoptosis neuronal cell number of the above areas inTRPC1 knockout mice was significantly increased compared with the control mice. The results of Western blot revealed that the levels of CHOP and cleaved caspase-3 were significantly increased in the hippocampus ofTRPC1 knockout mice relative to the control mice. CONCLUSION: The depletion of TRPC1 induces neuronal loss through a mechanism of TRPC1-mediated apoptosis.

Transient receptor potential channel 1; Neuron; C/EBP homologous protein; Caspase-3

1000- 4718(2016)04- 0686- 05

2015- 11- 20

2016- 02- 26

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2014A030313715);深圳市科技研發(fā)基金基礎(chǔ)研究項目(No. JCYJ20130329103949650)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.017

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通迅作者 許華 Tel: 020-38375022; E-mail: huax_mail@126.com; 楊細(xì)飛 Tel: 0755-25601914; E-mail: xifeiyang@gmail.com