李若彤，　王　麗，　曹　亭，　陳圣文，　費(fèi)洪榮，　王鳳澤△

(1泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000； 泰山醫(yī)學(xué)院 2生命科學(xué)學(xué)院， 3藥學(xué)院,山東 泰安 271016)

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Perifosine通過(guò)抑制PI3K/Akt途徑調(diào)節(jié)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡與自噬*

李若彤1，王麗2，曹亭2，陳圣文2，費(fèi)洪榮3，王鳳澤2△

(1泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000； 泰山醫(yī)學(xué)院2生命科學(xué)學(xué)院，3藥學(xué)院,山東 泰安 271016)

目的： 探討Akt激酶抑制劑perifosine對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和自噬的影響，確定perifosine誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與其促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。方法：Perifosine處理U251細(xì)胞后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)分析perifosine對(duì)U251細(xì)胞周期的影響；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)perifosine對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用；免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)P21、P27和cyclin B1等細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白以及caspase-9、PARP等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志分子LC3-II的分布與表達(dá)來(lái)確定perifosine對(duì)自噬的誘導(dǎo)作用。結(jié)果：Perifosine劑量依賴性地抑制U251細(xì)胞活力，能夠通過(guò)抑制cyclin B1的表達(dá)而阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期于G2期。Perifosine促進(jìn)了U251細(xì)胞內(nèi)caspase-9和PARP的剪切，抑制survivin表達(dá)，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)，perifosine與自噬抑制劑氯喹聯(lián)用后，U251細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加。結(jié)論：Perifosine能夠抑制U251細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬，抑制自噬促進(jìn)了perifosine誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

Perifosine； Akt； 膠質(zhì)瘤； 細(xì)胞凋亡； 自噬

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活和分化等生理病理活動(dòng)。由于11該信號(hào)途徑上游抑制因子PTEN 的突變，或者PI3K基因的擴(kuò)增及Akt 的過(guò)度活化，導(dǎo)致PI3K/Akt 信號(hào)通路在人類腫瘤譜中廣泛失調(diào)[1-2]。因此，抑制該通路可能成為惡性腫瘤治療的有效手段。Perifosine是新型的烷基磷脂類化合物，主要通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 和MAPK 等信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用[3-4]。我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)perifosine能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，表現(xiàn)出良好的體外抗腫瘤活性[5]。本研究以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251為實(shí)驗(yàn)材料，探討perifosine抑制細(xì)胞增殖的分子機(jī)理，在觀察perifosine對(duì)U251細(xì)胞凋亡和自噬影響的同時(shí)，分析perifosine誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與其促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

材　料　和　方　法

1實(shí)驗(yàn)材料

Perifosine購(gòu)自Selleck Chemicals；胎牛血清購(gòu)自Gibco；MTT、氯喹(chloroquine，CQ)、碘化丙啶(propidium iodine，PI)、β-actin抗體和LC3-Ⅱ抗體購(gòu)自Sigma；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Biosciences；Akt抗體、caspase-9 抗體、PARP抗體、survivin抗體和Cdc2抗體購(gòu)自CST；CyclinB1抗體購(gòu)自Santa Cruz；P21抗體和P27抗體購(gòu)自BD Biosciences；p-Akt 抗體購(gòu)自Abcam；II 抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，在37 ℃、5% CO2條件下，用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力胰酶消化U251細(xì)胞并接種于96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后加入不同劑量的perifosine 處理24 h，對(duì)照組加入PBS。終止培養(yǎng)前4 h，加20 μL MTT(5 g/L)于各個(gè)孔中。吸去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期不同濃度的perifosine作用細(xì)胞24 h后，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，然后加入預(yù)冷的75%無(wú)水乙醇于4 ℃固定18 h。接著用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入終濃度為50 mg/L RNase A于37 ℃孵育30 min；加入終濃度為50 mg/L的PI于4 ℃閉光染色20 min，然后上機(jī)檢測(cè)分析各組細(xì)胞的周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，根據(jù)Annexin V-FITC/PI的熒光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞凋亡百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5免疫印跡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)不同劑量perifosine處理24 h后，進(jìn)行免疫印跡分析。各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次后，用預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液冰上裂解30 min，然后4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，收集上清并用BCA 法定量。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；再用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加入 I 抗，室溫孵育3h后加入 II 抗，最后ECL 發(fā)光液曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3 融合蛋白的表達(dá)接種U251細(xì)胞于6 孔板中，待細(xì)胞融合至80% 左右用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染GFP-LC3 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h 后，加入不同濃度的perifosine 繼續(xù)處理24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白一般呈彌散狀態(tài)分布于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，GFP-LC3 融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成明亮的綠色斑點(diǎn)(相當(dāng)于自噬體)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1Perifosine抑制U251細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化

Akt 第473 位點(diǎn)絲氨酸磷酸化(p-AktS473)增強(qiáng)通常被作為Akt激活的指標(biāo)。由于perifosine是Akt 的抑制劑，所以本研究首先檢測(cè)了perifosine對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)Akt 磷酸化(p-AktS473)的抑制作用。免疫印跡結(jié)果顯示經(jīng)perifosine處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化水平顯著受到抑制，且抑制作用呈劑量依賴性。細(xì)胞內(nèi)總Akt 的表達(dá)量無(wú)明顯變化,見(jiàn)圖1。

2Perifosine阻滯U251細(xì)胞于G2期

用MTT法檢測(cè)了perifosine作用24 h 后對(duì)U251細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示perifosine可顯著抑制U251細(xì)胞活力，且抑制作用呈劑量依賴性,見(jiàn)圖2。用流式細(xì)胞術(shù)分析了perifosine對(duì)U251細(xì)胞周期的影響，結(jié)果如圖3和表1所示，perifosine處理24 h后，處于G2期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明perifosine能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯。

Figure 1.The protein levels of p-Akt and total Akt in the U251 cells treated with perifosine for 24 h determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖1Perifosine 抑制U251細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化

Figure 2.The effects of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the viability of the U251 cells determined by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖2Perifosine抑制U251細(xì)胞活力

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，perifosine抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中P27和cyclin B1的表達(dá)，而P21的蛋白水平則隨著perifosine的濃度增加而上調(diào)，但Cdc2的表達(dá)水平無(wú)明顯變化,見(jiàn)圖4。

3Perifosine 誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生凋亡

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡如同抑制細(xì)胞增殖一樣，也是小分子藥物抗腫瘤作用的重要理論依據(jù)。因此，我們采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)perifosine對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。如同對(duì)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，較高濃度的perifosine同樣促進(jìn)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251發(fā)生凋亡,見(jiàn)表2。

免疫印跡法檢測(cè)了perifosine對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白活性及表達(dá)水平的影響。發(fā)現(xiàn)較高濃度的perifosine促進(jìn)了胱天蛋白酶家族成員caspase-9和PARP的切割，而凋亡抑制蛋白survivin的表達(dá)則逐漸降低，見(jiàn)圖5。

Figure 3.Upon exposure to perifosine for 24 h, U251 cells exhiibted G2phase arrest.

圖3Perifosine誘導(dǎo)U251細(xì)胞阻滯于G2期

表1Perifosine誘導(dǎo)U251細(xì)胞周期阻滯于G2期

Table 1.Upon exposure to perifosine for 24 h, U251 cells exhi-bited G2phase arrest (%. Mean±SD.n=3)

Perifosine(μmol/L)G0/G1SG2/M066.86±3.7518.53±1.5114.27±1.38559.26±3.77*17.89±1.6323.68±1.82*1041.31±2.93*18.03±1.8739.20±2.49*

*P<0.05vs0 μmol/L.

4Perifosine抑制U251細(xì)胞發(fā)生自噬

轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)perifosine處理24 h 后，GFP-LC3 細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)狀分布增加，證實(shí)perifosine能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生,見(jiàn)圖6。同時(shí)，免疫印跡法檢測(cè)perifosine對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度的perifosine處理細(xì)胞后，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平明顯增多，進(jìn)一步證明perifosine能夠誘導(dǎo)U251細(xì)胞發(fā)生自噬,見(jiàn)圖7。

Figure 4.The effects of perifosine treatment at different concentrations for 24 h on the expression of cell cycle-associated proteins in the U251 cells. Cell lysates were analyzed by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4Perifosine對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

表2　Perifosine 促進(jìn)U251細(xì)胞發(fā)生凋亡

*P<0.05vs0 μmol/L.

5抑制自噬促進(jìn)perifosine誘導(dǎo)的U251細(xì)胞凋亡

CQ是特異性自噬抑制劑，主要抑制細(xì)胞內(nèi)自噬體和溶酶體的融合[6]。U251細(xì)胞經(jīng)CQ(10 μmol/L)與perifosine(20 μmol/L)聯(lián)合作用24 h后，Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)了細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果表明抑制自噬促進(jìn)了perifosine誘導(dǎo)的U251細(xì)胞凋亡，見(jiàn)表3。同時(shí)免疫印跡結(jié)果顯示，自噬抑制劑CQ與perifosine 聯(lián)用促進(jìn)了PARP的切割，見(jiàn)圖8。

Figure 5.The effects of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the levels of apoptosis-related proteins in the U251 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖5免疫印跡檢測(cè)perifosine對(duì)U251細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的影響

Figure 6.Representative images of GFP-LC3 in the U251 cells transfected with GFP-LC3 plasmid. After transfection for 24 h, the cells were treated with perifosine for another 24 h.

圖6Perifosine對(duì)U251細(xì)胞GFP-LC3融合蛋白表達(dá)的影響

討　　論

膠質(zhì)瘤是成人常見(jiàn)的惡性腦腫瘤，其侵襲性強(qiáng)，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。盡管治療手段不斷進(jìn)步，但中位生存期仍無(wú)明顯改進(jìn)。目前膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)治療為主，化療則是常規(guī)的輔助治療方法，但化療藥物的獲得性耐藥使得化療效果較差，因此迫切需要尋找新的藥物來(lái)輔助膠質(zhì)瘤的手術(shù)治療。PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)途徑在膠質(zhì)瘤中過(guò)度活化[7-8]，提示該通路與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，而PI3K和Akt激酶或許成為膠質(zhì)瘤臨床治療的有效靶點(diǎn)。

Perifosine作為新型的Akt抑制劑，能夠通過(guò)抑制Akt和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化而抑制小鼠膠質(zhì)祖細(xì)胞的增殖[9]。本研究以U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，主要探討Akt抑制劑perifosine對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響。我們發(fā)現(xiàn)，perifosine能夠阻滯細(xì)胞于G2期而抑制增殖；通過(guò)促進(jìn)caspase-9和PARP的切割，抑制survivin的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖失控是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，而細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是增殖失控的根本原因。因此，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死一樣已成為腫瘤治療的重要途徑之一。細(xì)胞周期蛋白是真核細(xì)胞周期進(jìn)程的主要調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)結(jié)合形成cyclin-CDKs 復(fù)合物共同調(diào)控著細(xì)胞周期[10]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞經(jīng)藥物或輻射處理后，通常出現(xiàn)G1/S期或G2/M期阻滯，以便修復(fù)受損的DNA。Cdc2/cyclin B1作為G2期檢驗(yàn)點(diǎn)的重要開(kāi)關(guān)，與Cdc25C相互作用于細(xì)胞周期，開(kāi)啟細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程[11]。本研究用perifosine處理U251細(xì)胞后，cyclin B1的蛋白水平下調(diào)，使Cdc2/cyclin B1 復(fù)合物的活性降低，從而發(fā)生G2期阻滯。

Figure 7.The effect of perifosine treatment for 24 h at different concentrations on the expression of LC3-II in the U251 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖7Perifosine對(duì)U251細(xì)胞中LC3-II表達(dá)的影響

表3抑制自噬增強(qiáng)perifosine誘導(dǎo)的U251細(xì)胞凋亡

Table 3.The effects of autophagic inhibitor chloroquine (CQ) on perifosine-induced cell apoptosis (Mean±SD.n=3)

TreatmentEarlyapoptoticrate(%)Lateapoptoticornecroticrate(%)Control1.36±0.644.25±1.33Perifosine5.03±1.95*5.80±2.17CQ2.53±0.866.38±1.75Perifosine+CQ12.07±3.72*#11.40±3.69*#

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsperifosine group.

Figure 8.U251 cells were treated with 20 μmol/L perifosine and/or with 10 μmol/L CQ for 24 h, and the protein level of cleaved PARP was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsperifosine group.

圖8CQ抑制自噬增強(qiáng)perifosine誘導(dǎo)的PARP切割

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞所特有的一種胞內(nèi)代謝途徑，細(xì)胞通過(guò)自我消化折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)或受損的細(xì)胞器，為機(jī)體提供物質(zhì)能量從而保證大分子的合成[12]。自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究證明自噬能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生非凋亡途徑的細(xì)胞死亡；但越來(lái)越多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自噬不但能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，而且與腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性相關(guān)[13-15]。當(dāng)用化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，產(chǎn)生耐藥性，而與自噬抑制劑聯(lián)用能夠減弱這種耐藥性[16]。本研究中，我們觀察了perifosine對(duì)U251細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)perifosine促進(jìn)了U251細(xì)胞發(fā)生自噬，抑制自噬增強(qiáng)了perifosine誘導(dǎo)的U251細(xì)胞凋亡，表明perifosine誘導(dǎo)的U251細(xì)胞自噬對(duì)細(xì)胞是保護(hù)性的。

總之，perifosine能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和自噬。抑制自噬增強(qiáng)了perifosine誘導(dǎo)的U251細(xì)胞凋亡，本研究為膠質(zhì)瘤的臨床輔助治療提供了新的策略。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Perifosine regulates human brain glioma U251 cell proliferation, apoptosis and autophagy through suppression of PI3K/Akt pathway

LI Ruo-tong1, WANG Li2, CAO Ting2, CHEN Sheng-wen2, FEI Hong-rong3, WANG Feng-ze2

(1SchoolofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271000,China;2SchoolofLifeSciences,3SchoolofPharmaceuticalSciences,TaishanMedicalUniversity,Tai’an271016,China.E-mail:wfz221@sina.com)

AIM: To investigate the effect of perifosine, an inhibitor of protein kinase B (PKB/Akt), on the cell cycle, apoptosis and autophagy in human brain glioma U251 cells, and to determine the relationship between perifosine-induced autophagy and apoptosis of glioma. METHODS: The cell growth inhibition was determined by MTT assay. The cell cycle distribution of U251 cells was examined by flow cytometry. The cell apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC apoptosis detection kit. The protein expression of P21, P27, cyclin B1, caspase-9 and PARP was examined by Wes-tern blot analysis. The distribution and expression of LC3-II, an autophagy marker, was observed to determine the effect of perifosine-induced autophagy. RESULTS: Perifosine inhibited the cell viability in a dose-dependent manner. In perifosine-treated U251 cells, the cell cycle was arrested in G2phase and the expression of cyclin B1 was inhibited. Perifosine induced apoptosis of U251 cells through activation of caspase-9 cleavage, PARP cleavage and survivin inhibition. In addition, suppression of autophagy by chloroquin, an inhibitor of autophagy, increased the number of apoptotic cells. CONCLUSION: Perifosine inhibits cell proliferation and triggers apoptosis and autophagy in human U251 cells. Blocking autophagy magnifies perifosine-induced glioma cell apoptosis.

Perifosine; Akt; Glioma; Apoptosis; Autophagy

1000- 4718(2016)04- 0644- 07

2015- 10- 27

2015- 12- 31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272683)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(No.J15LM09)

Tel: 0538-6236991； E-mail: wfz221@sina.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.011

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