黃　杰　李麗茹　張　斌

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院，上?！?01400)

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亞低溫對大鼠局灶性腦缺血再灌注后凋亡相關蛋白表達的影響及保護作用

黃杰李麗茹張斌

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院，上海201400)

目的通過檢測絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)及Caspase-9蛋白的表達，探討亞低溫對局灶性腦缺血再灌注(IR)后神經元存活的影響。方法用Longa線拴法制作局灶性腦IR模型，將40只SD大鼠隨機分成正常組、假手術組、常溫組和亞低溫組，常溫組和亞低溫組均缺血8 h,再灌注4 h、24 h、72 h、1 w(n=4)與相應時間點處死，亞低溫組于腦缺血后12～15 min實施病灶側亞低溫持續(xù)4 h。免疫組化法檢測AKT及Caspase-9蛋白的表達。結果不同缺血再灌注時間點，亞低溫組比常溫組缺血側半暗帶AKT表達水平顯著增高(P<0.05)，Caspase-9顯著降低(P<0.05)。結論亞低溫通過促進缺血半暗帶腦組織AKT表達，抑制Caspase-9表達，從而抑制神經元凋亡，減少神經元損害。

腦缺血;亞低溫;凋亡;絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶;Caspase-9

研究表明絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)參與腦缺血再灌注(IR)后神經元凋亡過程〔1〕，亞低溫對于腦缺血的保護作用是多方面的〔2〕，AKT、Caspase-9作為重要的細胞損傷相關因子越來越受到關注。本實驗建立大腦中動脈梗死缺血模型觀察亞低溫對AKT、Caspase-9在腦缺血半暗帶區(qū)的影響及亞低溫的可能機制。

1　材料和方法

1.1動物與分組選擇清潔級健康雄性SD大鼠40只，體重180～200 g，鼠齡6～8 w。由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心〔生產許可證號:SCXK(黑)20020002〕提供，標準環(huán)境下飼養(yǎng)(常溫自由進食飲水)。大鼠隨機分為正常組(n=4)，假手術組(n=4)，常溫組(n=16)和亞低溫組(n=16)，其中常溫及亞低溫組分別在缺血8 h后再4 h,24 h,72 h和1 w，每個時間點4只。

1.2主要試劑和儀器一抗AKT、Caspase-9購自武漢博士德生物工程有限公司，二抗試劑盒購自北京中杉金橋公司，步驟同說明書。亞低溫組采用可調控亞低溫儀(哈爾濱工業(yè)大學熱工教研室研制,專利號ZL98230936.0)。

1.3動物模型制備手術參考改良的Nagasawa等〔3〕方法，制備大鼠左側大腦中動脈(MCA)缺血再灌注模型，在30 min 內完成模型制作，亞低溫組于腦缺血后12～15 min誘導頭部亞低溫MCA 缺血8 h 后將尼龍線抽出頸內動脈(ICA)即可恢復MCA 血液供應。MCA 閉塞后13～15 min內把腦溫誘導至31℃～32℃并持續(xù)2～4 h，實驗后脫離溫度調節(jié)，讓大鼠自然復蘇。MCA 閉塞后6 h 將大鼠處死，進行組織處理和染色。假手術組不將尼龍線插入ICA，其余操作同常溫組及亞低溫組。

1.4組織標本的制備各組大鼠分別于IR后各時間點經心臟插管,生理鹽水沖洗,然后灌注4%甲醛內固定取腦，于視交叉后3 mm 處取3 mm 厚組織，置于4%多聚甲醛液中固定24 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋，冠狀面連續(xù)切片，厚度約3 μm，分別行HE 染色、免疫組化染色。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件行方差分析和t檢驗。

2　結　果

2.1常溫組與亞低溫組AKT、Caspase-9 陽性細胞數比較見表1，圖1。AKT 陽性細胞主要位于缺血半暗帶區(qū)域。缺血24 h時達高峰，其后下降。亞低溫組比常溫組AKT陽性細胞數顯著增高(P<0.05)。Caspase-9腦缺血再灌注4 h即有表達，主要位于缺血半暗帶，腦缺血再灌注24 h達高峰并持續(xù)到72 h，之后降低，亞低溫與常溫組相比，陽性細胞數明顯減少(P<0.05)。

表1　亞低溫對局IR后AKT、Caspase-9表達影響

常溫組AKT(×132)

亞低溫組AKT(×200)

常溫組Caspase-9(×132)

亞低溫組Caspase-9(×132)

2．2各組大鼠腦組織病理學改變假手術組與正常組大鼠腦組織均未見明顯異常。常溫組大鼠可見左側大腦皮質有梗死灶，呈典型的缺血性改變，組織水腫明顯，神經元變性、壞死。梗死灶與周圍腦組織界限清楚，其中心區(qū)神經元數量明顯減少。亞低溫組腦梗死灶較腦缺血組明顯減小，腦組織缺血性改變和腦水腫明顯減輕，見圖2。

圖2　常溫及亞低溫腦缺血病灶(HE，×200)

3　討　論

20世紀90年代，臨床應用28℃～35℃亞低溫治療重型顱腦損傷和急性腦卒中取得了良好的效果，可能保護機制包括對于亞低溫治療腦梗死的作用機制考慮可能抑制一氧化氮(NO)、白三烯等的生成和釋放,減少腦細胞的代謝，降低酸中毒;抑制致炎細胞因子的生成和釋放;減少鈣離子內流;促進腦細胞結構與功能的修復，抑制壞死和線粒體釋放細胞色素C(CytC)誘導神經元凋亡〔4,5〕。目前國內外有關細胞凋亡研究出現的時間說法不一可能與多種因素有關〔6〕。

PI3/AKT是細胞內重要的信號轉導分子，活化的AKT通過磷酸化作用進一步激活或抑制其下游靶蛋白，進而發(fā)揮調節(jié)細胞的增殖、分化等作用。AKT，是PI3K直接的下游作用靶點，具有抗凋亡作用，其抗凋亡作用一方面可通過磷酸化并激活下游的凋亡調控蛋白，如Caspase-9、NF-κB等，調節(jié)抗凋亡基因的轉錄。對PI3K/Akt途徑的調控可以降低損傷及IR引起的腦損傷，AKT在腦缺血后對于缺血區(qū)神經元具有保護作用，起保護作用是多方面的，可能通過眾多的信號通路來完成其抗凋亡作用〔7,8〕。本研究提示亞低溫可抑制腦缺血后細胞凋亡，減輕缺血性腦水腫、腦損害，明顯縮小腦梗死體積，具有腦保護作用。

本實驗發(fā)現AKT、Caspase-9表達陽性細胞多位于缺血半暗帶區(qū)，參與缺血后神經細胞凋亡，亞低溫治療可使AKT的表達上調，Caspase-9的表達下調，提示亞低溫治療可能抑制或延緩了細胞凋亡，說明亞低溫對于腦缺血具有護作用。

綜上所述，本研究推測亞低溫可能通過AKT信號途徑抑制細胞凋亡，對腦IR后的損傷起到保護作用。

1Wang HY，Wang GL，Yu YH，etal． The role of phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway in propofol-induced postconditioning against focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Brain Res，2009；1297:177-84．

2Roberto Alexandre Dezena,Benedicto Oscar Colli,Carlos Gilberto Carlotti Junior,etal.Pre,intra and post-ischemic hypothermic neuroprotection in temporary focal cerebral ischemia in rats:morphometric analysis〔J〕.Arq Neuropsiquiatr，2012;70(8):609-16.

3Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic hanges in a new rat model of middle cerebral artery occlusion〔J〕.Stroke，1989;20(8):1037-43.

4宋祖軍，馬俊清，余厚友,等.亞低溫對大鼠急性脊髓損傷后炎性細胞因子表達的影響〔J〕.中國急救醫(yī)學雜志，2009;29(2)：137-9.

5Wang JK，Yu LN，Zhang FJ，etal.Post conditioning with sevoflurane protects against focal cerebral ischemia and reperfusion injury via PI3K/Akt pathway〔J〕.Brain Res，2010;1357:142-51．

6Choi R,Andres RH,Steinberg GK,etal.Intraoperative hypothermia during vascular neurosurgical procedures〔J〕.Neurosurg Focus,2009;26:E24.

7Luca Filippi,Patrizio Fiorini,Marta Daniotti,etal.Safety and efficacy of topiramate in neonates with hypoxic ischemic encephalopathy treated with hypothermia〔J〕.Neo Nati.BMC Pediat,2012;12:144.

8Yuan Y，Guo Q，Ye Z，etal． Ischemic postconditioning protects brain from ischemia /reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis through PI3K-Akt pathway〔J〕.Brain Res,2011;1367(1):85-93．

〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

上海市衛(wèi)生局面上項目(No.20124286)；上海市奉賢區(qū)科委(No.奉科2010-101101；奉科2013-101102)

李麗茹(1970-)，女，主任醫(yī)師，副教授，主要從事心腦血管疾病的基礎與臨床研究。

黃杰(1970-)，男，碩士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事神經疾病的臨床與基礎研究。

R743.1

A

1005-9202(2016)17-4153-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.007