羅　丁　張雪淳　肖　瑤　劉　月　王　琳　符文彬

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東　廣州　510405)

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電針對CUMS大鼠前額皮層星形膠質細胞GS、EAAT1、EAAT2的影響

羅丁1張雪淳肖瑤2劉月王琳1符文彬1

(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東廣州510405)

目的觀察電針對CUMS大鼠前額皮層星形膠質細胞谷氨酰胺合成酶(GS)、EAAT1、EAAT2的影響。方法將56只雄性SD大鼠隨機分為正常組、空白組、針刺組和藥物組，每組14只。除正常組常規(guī)飼養(yǎng)外，空白組、針刺組和藥物組大鼠予慢性不可預見性溫和刺激建立抑郁模型。造模成功后，空白組單籠飼養(yǎng)、只給予相同程度的捉抓；針刺組單側交替取太沖、合谷穴予連續(xù)波、2 Hz電針刺激，1次/d、30 min/次，連續(xù)治療35 d；藥物組予利魯唑4 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)給藥35 d。用曠場實驗和糖水偏好實驗評價大鼠行為學，用Western印跡技術從蛋白水平觀察前額皮層星形膠質細胞高親和性興奮性氨基酸轉運體EAAT1、EAAT2蛋白以及GS的變化，應用RT-PCR技術從mRNA水平檢測EAAT1 mRNA、EAAT2 mRNA、GS mRNA的變化。結果行為學藥物組和電針組均能改善因CUMS造模導致的曠場實驗的水平爬格、直立站立次數降低，治療至第14天時可達正常水平(P>0.05)；糖水偏好率也于治療第7天開始得到糾正(P>0.05)；電針組和藥物組對行為學的改善程度相當(P>0.05)。行為學的改善與前額皮層GS、EAAT1、EAAT2和EAAT1 mRNA、EAAT2 mRNA、GS mRNA升高相對應。結論電針上調前額皮層星形膠質細胞高親和性興奮性氨基酸轉運體EAAT1、EAAT2和GS表達，提高谷氨酸攝取功能，從而改善抑郁癥狀，可能是針刺抗抑郁的機制之一。

電針；抑郁；星形膠質細胞；EAAT1；EAAT2；GS

膠質細胞一直被認為是中樞神經系統(tǒng)中輔助神經元完成功能的次要結構，其與神經元的構成比例與物種和不同腦區(qū)相關〔1〕。然而，近年來研究者們發(fā)現膠質細胞與神經細胞相互作用、共同發(fā)起與維持神經活動，參與了諸多神經精神生理和病理活動〔2〕。膠質細胞成分還是許多神經精神疾病的病理基礎〔3〕。星形膠質細胞(As)是腦內谷氨酸代謝主要途徑——“谷氨酸能三重突觸”結構的重要組成部分，通過EAAT1、EAAT2對細胞間隙興奮性神經遞質谷氨酸含量及谷氨酸/谷胺酰胺循環(huán)的動態(tài)調節(jié)與抑郁癥發(fā)生密切相關〔4,5〕。針刺能有效降低抑郁癥及其相關心境障礙患者的各項抑郁、焦慮量表評分，提高生活質量〔6〕，可能與針刺能有效糾正抑郁狀態(tài)下中樞神經系統(tǒng)神經膠質細胞的異常超微結構、改善膠質細胞和神經細胞能量代謝相關〔7,8〕。然而，針刺啟動As保護環(huán)節(jié)的內在確切機制尚不明確。本研究擬從As谷氨酸興奮性轉運體EAAT1、EAAT2谷氨酸攝取環(huán)節(jié)探討電針抗抑郁的確切靶點，為針刺臨床應用提供機制支持。

1　材料與方法

1.1動物與分組將廣東省實驗動物中心提供體重260～300 g的健康雄性SD大鼠56只，隨機分為正常組、空白組、針刺組和藥物組，每組10只。正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，空白組、針刺組和藥物組采用慢性不可預見溫和型刺激聯(lián)合孤養(yǎng)造模。

1.2模型制備以7 d為1個周期，大鼠依次接受禁食、禁水、傾籠、晃尾、夾尾、冰水、晝夜顛倒、電擊足底8種不同刺激，由弱到強、循環(huán)往復，共進行5個周期，時長35 d。完成造模后用行為學指標判斷是否造模成功，造模成功的大鼠接受電針或藥物干預。

1.3實驗干預空白組和對照組大鼠均單籠飼養(yǎng)，不予任何處理，僅進行相同程度的捉抓；針刺組取交替單側太沖、合谷予連續(xù)波、2 Hz電針刺激，以大鼠肢體微微抽動為度，1次/d、30 min/次，連續(xù)治療35 d；藥物組予利魯唑4 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)給藥35 d。

1.4指標測量

1.4.1行為學檢測曠場實驗(OFT)：選用四周及底部均涂黑、規(guī)格為80 cm×80 cm×40 cm的無蓋木箱，用白線將木箱底部劃分為25個16 cm×16 cm的方格，沿墻格為外周格，其余為中央格。用攝像頭記錄大鼠放置在中央格后、3 min內的活動軌跡，分別記錄水平穿越方格數和直立站立次數。

糖水偏好實驗(SPT)：實驗準備階段，鼠籠中放置兩個外形相同的動物水瓶，第1個和第2個24 h分別放置等重的1%蔗糖水和純凈水，隨后禁食水24 h。實驗階段，同時給予1%蔗糖水和純凈水1瓶，24 h后測量糖水和純凈水的消耗量。

1.4.2高親和性興奮性氨基酸轉運體EAAT1、EAAT2蛋白表達情況大鼠完成干預后腹腔麻醉處死，4℃多聚甲醛灌注后斷頭取腦、分離前額。冰上操作，稱取10～100 mg組織加入組織裂解液0.5 ml剪碎勻漿，離心，提取總蛋白。采用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，PVDF 膜轉膜，山羊抗兔IgG(H+L) HRP 1∶20 000抗體孵育，ECL顯影發(fā)光。膠片感光、顯影、定影后，用801成像系統(tǒng)測定條帶的光密度、進行灰度值分析(GAPDH為內參)，谷氨酰胺合成酶(GS)、EAAT1、EAAT2的表達水平分別以GS、EAAT1、EAAT2/GAPDH表示。

1.4.3高親和性興奮性氨基酸轉運體EAAT1、EAAT2基因mRNA轉錄水平情況用CWbio試劑盒提取各組樣品的總RNA，用1%瓊脂糖檢測RNA完整性后，消化處理RNA中殘留的DNA，完成反轉錄后用ABI熒光定量PCR儀進行定量，采用2-△△CT法進行相對定量分析。引物序列：EAAT1上游 5'-GCCATCATGAGATTGGTAGCGGT-3'，187 bp，下游5'- GGAAGTAGAGGAGAGGCAGGACGA-3'，187 bp;EAAT2上游5'- GAACTTCGGTCAATGTAGTGGGCG-3'，132 bp，下游5'- TGGACTGCGTCTTGGTCATTTCG-3'，132 bp；GS 上游5'-GCTGGTGTTATGTGAAGTTTTCAAG-3'，73 bp，下游5'-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAA-3' ，73 bp；βactin上游 5'- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，150 bp，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3',150 bp。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0軟件，計量資料服從正態(tài)分布組間比較采用方差分析，偏態(tài)分布比較采用非參數檢驗，多時點組間比較采用重復測量方差分析，不滿足協(xié)方矩陣或球形檢驗采用矯正檢驗。

2　結　果

2.1曠場實驗

2.1.1大鼠水平爬格數目CUMS造模使大鼠的水平爬格數均較正常組顯著降低(P<0.05)，空白組、電針組和藥物組間無差異(P>0.05)。治療第7、14、21、35天，電針組和藥物組大鼠水平爬格數均較空白組顯著增加(P<0.05)，且抑郁模型大鼠隨著時間的累積，爬格數逐漸升高，但電針組、藥物組在治療21、35 d時可與正常組大鼠爬格數相當(P>0.05)；電針組和藥物組各時點均間無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

表1　干預后大鼠水平爬格數目,個,n=14)

與正常組比較：1)P<0.05；與空白組比較：2)P<0.05；下表同

2.1.2大鼠垂直站立次數治療前CUMS模型組大鼠大鼠垂直站立次數均顯著下降(P<0.05)；治療第7、14、21、35天，空白組大鼠垂直站立次數較正常組顯著減少(P<0.05)，電針組、藥物組較空白組顯著增加(P<0.05)、較正常組無顯著差異(P>0.05)；電針組和藥物組各時點均間無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2　干預后大鼠垂直站立次數,次,n=14)

2.2糖水偏好實驗干預前，對照組、針刺組、藥物組大鼠糖水偏好率組間無明顯差異(P>0.05)。在干預第7、14、21、35天，電針組和藥物組糖水偏好情況相對空白組有顯著改善(P<0.05)；空白組、針刺組、藥物組組間無明顯差異(P>0.05)；治療第14、21、35天，與正常組比較，各組間無明顯差異(P>0.05)。見表3。

2.3前額皮層高親和性興奮性氨基酸轉運體EAAT1、EAAT2蛋白表達前額皮層空白組GS顯著低于正常組(P<0.05)，電針組和藥物組GS表達均高于空白組(P<0.05)，與正常組無差異；各組間EAAT1、EAAT2表達趨勢與GS相近，空白組大鼠均較其他組表達水平低(P<0.05)，電針組和藥物組均高于空白組，而電針組和藥物組之間無差異(P>0.05)。見圖1、表4。

2.4前額皮層GS、EAAT1、EAAT2 mRNA表達空白組GS mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，電針組和藥物組GS均較空白組升高(P<0.05)；空白組、電針組和藥物組的EAAT1表達均較正常組下降，電針組較空白組無差異，藥物組較空白組、電針組表達升高(P<0.05)；空白組、電針組、藥物組EAAT2均較正常組表達下調(P<0.05)。見表5。

1～8：每組8個樣本圖1　大鼠前額葉皮層GS 、EAAT1 、EAAT2蛋白含量

組別GSEAAT1EAAT2正常組0.62±0.270.56±0.370.62±0.27空白組0.34±0.180.28±0.190.34±0.18電針組0.52±0.171)2)0.45±0.081)2)0.52±0.172)藥物組0.60±0.032)0.52±0.040.60±0.03

表5　前額皮層GS、EAAT1、EAAT2 mRNA表達

3　討　論

As與神經元構成的神經元-膠質信號網絡是腦內信息傳遞的主要途徑，其中As參與構成的“谷氨酸能三重突觸”結構是調節(jié)哺乳動物CNS中興奮性神經遞質谷氨酸的重要結構，由突觸前神經元-膠質細胞-突觸后神經元組成，是腦內谷氨酸循環(huán)和再利用的重要途徑〔9〕。谷氨酸能神經元釋放谷氨酸至突觸間隙，通過突觸后膜的離子型和代謝型谷氨酸受體轉導沖動從而發(fā)揮生理作用；當谷氨酸水平積累過高，可觸發(fā)負反饋調節(jié)，啟動EAAT1、EAAT2和GS加大As對谷氨酸的重吸收，從加快突觸傳遞、降低突觸間谷氨酸含量兩方面維持神經元突觸功能穩(wěn)定的重要作用〔10〕。GS在“谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)”中的主要功能是將As胞內的谷氨酸合成為谷氨酰胺，是谷氨酸分解代謝的重要環(huán)節(jié)，從GS功能的情況可以推斷谷氨酸的代謝及“谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)”的情況。作為As上的高親和興奮性氨基酸轉運體，EAAT1、EAAT2可攝取80%～90%突觸前神經元釋放的谷氨酸，將突觸間隙的谷氨酸維持在較低濃度，避免發(fā)生興奮性氨基酸毒性〔11〕。

無論是動物實驗或是尸檢研究，均證實抑郁大鼠或是患者的前額葉等腦區(qū)出現EAAT1和EAAT2的表達下調〔12,13〕。臨床研究還表明，長期情緒應激損傷AS的興奮性氨基酸轉運功能，突觸間隙谷氨酸逐漸累積進而誘發(fā)興奮性氨基酸毒性〔13〕。故上調As的EAATs表達水平，加快谷氨酸代謝，有助于改善抑郁樣癥狀。

目前針刺對星形膠質細胞的谷氨酸調節(jié)作用已在缺血性腦病實驗研究〔14〕中得到證實，表明電針可調節(jié)大鼠星形膠質細胞的作用而改善癥狀，可以提高星形膠質細胞谷氨酸轉運體EAAT1、EAAT2的表達，增強星形膠質細胞滅活谷氨酸的能力。本研究結果顯示，電針可以上調前額皮層As高親和性興奮性氨基酸轉運體EAAT1、EAAT2和GS表達，提高谷氨酸攝取功能，從而改善抑郁癥狀，這可能是針刺抗抑郁的機制之一。

1Rajkowska G,Miguel-Hidalgo JJ,Wei J,etal.Morphometric evidence for neuronal and glial prefrontal cell pathology in major depression〔J〕.Biol Psychiatry,1999;45(9):1085-98.

2Lee Y,Gaskins D,Anand A,etal.Glia mechanisms in mood regulation:a novel model of mood disorders〔J〕.Psychopharmacology (Berl),2007;191(1):55-65.

3Rajkowska G,Miguel-Hidalgo JJ.Gliogenesis and glial pathology in depression〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets,2007;6(3):219-33.

4Lebon V,Petersen KF,Cline GW,etal.Astroglial contribution to brain energy metabolism in humans revealed by 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy:elucidation of the dominant pathway for neurotransmitter glutamate repletion and measurement of astrocytic oxidative metabolism〔J〕.J Neurosci,2002;22(5):1523-31.

5Schousboe A,Waagepetersen HS.Glial modulation of GABAergic and glutamatergic neurotransmission〔J〕.Curr Top Med Chem,2006;6(10):929-34.

6樊凌，符文彬，許能貴，等.疏肝調神針灸方案治療抑郁癥的隨機對照研究〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2012;31(4):841-6.

7姜碩，黃彬，樊凌，等.電針四關穴對抑郁大鼠海馬星形膠質細胞形態(tài)的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2015;30(1):216-8.

8肖瑤，姜碩，符文彬，等.透射電鏡下電針對慢性應激致抑郁大鼠海馬AST結構和功能的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2014;33(5):1682-6.

9Machado-Vieira R,Manji HK,Zarate CA.The role of the tripartite glutamatergic synapse in the pathophysiology and therapeutics of mood disorders〔J〕.Neuroscientist,2009;15(5):525-39.

10Banasr M,Duman RS.Glial loss in the prefrontal cortex is sufficient to induce depressive-like behaviors〔J〕.Biol Psychiat,2008;64(10):863-70.

11Ozawa S.Role of glutamate transporters in excitatory synapses in cerebellar Purkinje cells〔J〕.Brain Nerve,2007;59(7):669-76.

12Miguel-Hidalgo JJ,Waltzer R,Whittom AA,etal.Glial and glutamatergic markers in depression,alcoholism,and their comorbidity〔J〕.J Affect Disord,2010;127(1-3):230-40.

13Banasr M,Chowdhury GM,Terwilliger R,etal.Glial pathology in an animal model of depression:reversal of stress-induced cellular,metabolic and behavioral deficits by the glutamate-modulating drug riluzole〔J〕.Mol Psychiatry,2010;15(5):501-11.

14羅燕，許能貴，易瑋，等.電針對局灶性腦缺血大鼠缺血灶周圍區(qū)星形膠質細胞谷氨酸轉運體的影響〔J〕.安徽中醫(yī)學院學報,2009;20(1):30-3.

〔2016-06-07修回〕

(編輯曲莉)

Effect of electric acupuncture on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex

LUO Ding,ZHANG Xue-Chun,XIAO Yao,et al.

The Second Medical Collage of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the electric acupuncture effect on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex.MethodsTotal 56 SD rats were randomly divided into normal,control,acupuncture and riluzole groups.Rats in control,acupuncture and Riluzole groups underwent CUMS.After finished CUMS,rats in control group were kept in single without any intervention.Rats in acupuncture group received continuous wave electric stimulating on LR3 and LI4 at frequency of 2 Hz once per day for 35 days.Rats in Riluzole group were given by gavage at dose of 4 mg/L once a day for 35 days.Open field test and sugar preference test were employed for behavior measure.Western blot and Rt-PCR were used for evaluating GS,EAAT1,EAAT2,EAAT1 mRNA,EAAT2 mRNA and GS mRNA expression.ResultsRats in control group showed decreased in lateral movement,stand upright of OFT and sugar preference.Both Riluzole and electric acupuncture could rectify the behavior after 7,14,21,35 days treatment.All of the remission of behavior defect may relevant to electric acupuncture effect on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex.ConclusionsOne of the underlying mechanism of antidepressant effect of electric acupuncture may involve to its effect on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex.

Electric acupuncture；Depression；Astrocyte；EAAT1；EAAT2；GS

國家自然科學基金(No.81173348)

符文彬(1963-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事針灸治療痛癥及抑郁相關病癥的研究。

羅丁(1985-)，女，博士，醫(yī)師，主要從事針刺治療抑郁相關病癥的研究。

R74

A

1005-9202(2016)17-4143-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.003

1廣東省中醫(yī)院2廣州醫(yī)科大學