丁國華　孫健　楊光　張鳳鳴　白良明　孫世臣　姜樹坤　王彤彤　鄭洪亮夏天舒　沈希宏　馬殿榮　陳溫福

(1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站/黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 耕作栽培研究所/中國科學(xué)院 北方粳稻分子育種聯(lián)合研究中心， 哈爾濱 155086；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所， 沈陽110866； 3 遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所， 遼寧 遼陽 111000； 4中國水稻研究所， 杭州 310006；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人， E-mail: madianrong@163.com； wfchen5512@126.com)

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干旱脅迫下雜草稻和栽培稻根系基因表達(dá)差異研究

丁國華1，2，#孫健2，#楊光3張鳳鳴1白良明1孫世臣1姜樹坤1王彤彤1鄭洪亮1夏天舒1沈希宏4馬殿榮2，*陳溫福2，*

(1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站/黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 耕作栽培研究所/中國科學(xué)院 北方粳稻分子育種聯(lián)合研究中心， 哈爾濱 155086；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所， 沈陽110866；3遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所， 遼寧 遼陽 111000；4中國水稻研究所， 杭州 310006；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人， E-mail: madianrong@163.com； wfchen5512@126.com)

DING Guohua, SUN Jian, YANG Guang, et al. Global genome expression analysis of root genes under drought stress in weedy rice and up-land rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 458-468.

利用Affymetrix水稻表達(dá)譜芯片(GeneChip Rice Genome Array)研究抗旱雜草稻HEB07-2與巴西陸稻(IAPAR9)在PEG模擬干旱脅迫下根系基因表達(dá)變化。結(jié)果表明,雜草稻HEB07-2轉(zhuǎn)錄組對(duì)干旱信號(hào)的響應(yīng)程度與方向均與巴西陸稻存在很大差異，HEB07-2以正向調(diào)控為主，而巴西陸稻以負(fù)調(diào)控為主。干旱脅迫下雜草稻HEB07-2與巴西陸稻分別有6878個(gè)和2923個(gè)基因表達(dá)，其中HEB07-2受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)的基因有4693個(gè)，下調(diào)的基因有2185個(gè)；而巴西陸稻則分別有983個(gè)和1940個(gè)。在差異基因表達(dá)的倍數(shù)上也是HEB07-2高于巴西陸稻。進(jìn)一步的GO分析表明，在干旱脅迫下，HEB07-2和IAPAR9根系基因響應(yīng)途徑的差異表現(xiàn)為HEB07-2在鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)(GO：0006813)、次生物質(zhì)代謝(GO：0019748)、細(xì)胞生長(zhǎng)(GO：0016049)、葡萄糖代謝(GO：0006006)、跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)器活性(GO：0015075)、亞鐵血紅素結(jié)合體(GO：0020037)、氧化還原酶活性(GO：0016491)等方面基因顯著上調(diào)，這與生理數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)一致。

雜草稻； 根系； 表達(dá)譜芯片； 耐旱

水稻(Oryzasativa)是重要的糧食作物，全世界一半以上的人口都將稻米作為主食[1]。我國是水稻生產(chǎn)大國，稻谷總產(chǎn)量世界第一，水稻生產(chǎn)耗水量大，占農(nóng)業(yè)用水的60%左右，水資源已經(jīng)成為限制水稻發(fā)展的一個(gè)潛在因素[2]。因此，培育抗旱節(jié)水的水稻新品種是本領(lǐng)域亟待解決的問題之一，而植物的耐旱性是典型的數(shù)量性狀，由眾多基因控制，十分復(fù)雜。關(guān)于作物耐旱的QTL研究較多[3-6]，但到目前為止沒有克隆一個(gè)與作物耐旱性相關(guān)的QTL，而基于耐旱性QTL進(jìn)行的分子輔助育種效果并不能令人滿意。

基因芯片使研究人員能夠快速、高通量地了解植物在特定環(huán) 境條件下的基因表達(dá)水平及變化[7-11]。Thomas等[9]利用芯片技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)耐旱性不同的水稻品種干旱脅迫下基因表達(dá)模式不同，長(zhǎng)期干旱脅迫下干旱敏感品種表達(dá)發(fā)生變化的基因數(shù)量較多。李永春等[10]用Affymetrix基因芯片研究小麥在模擬干旱脅迫(20% PEG-6000溶液)下根系基因表達(dá)譜，結(jié)果表明干旱脅迫后下調(diào)表達(dá)的基因4573個(gè)(5043個(gè)探針組)，上調(diào)表達(dá)的基因3743個(gè)(4074個(gè)探針組)。Zhang 等[11]利用表達(dá)譜芯片研究了干旱脅迫下巴豆苗期根系和葉片中基因表達(dá)狀況，干旱脅迫下有關(guān)生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞蛋白修飾、脫落酸合成、脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、棉籽糖合成、海藻糖合成相關(guān)基因顯著上調(diào)。

雜草稻是亞洲栽培稻的一級(jí)基因源，具有較強(qiáng)的抗逆性，是改良栽培稻的優(yōu)良基因庫[12-13]。利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)雜草稻與栽培稻全基因組基因在干旱脅迫下的表達(dá)變化情況，并進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)，對(duì)比雜草稻與栽培稻全基因組在特定條件下對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)狀況，從轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的層面揭示雜草稻和栽培稻在干旱脅迫下的基因組差異，進(jìn)一步發(fā)掘雜草稻可能存在的特殊抗旱機(jī)理，對(duì)于拓寬水稻耐旱遺傳基礎(chǔ)，培育節(jié)水抗旱水稻新品種具有重要意義。以往關(guān)于抗旱表達(dá)譜的研究往往基于抗旱樣本與干旱敏感樣本的相互比較。本研究將極抗旱種質(zhì)資源雜草稻HEB07-2與抗旱的陸稻樣本進(jìn)行表達(dá)譜差異分析，試圖從一個(gè)新的高度進(jìn)一步理解稻屬植物抗旱的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1植物材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料為北方雜草稻HEB07-2和巴西陸稻。選取飽滿的種子，經(jīng)10%次氯酸鈉消毒后，于30℃下恒溫催芽3 d，之后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的種子播于96孔PVP板中，并置于培養(yǎng)容器(長(zhǎng)24 cm×寬24 cm×高10 cm)中。在RXZ-500C人工氣候箱中進(jìn)行幼苗培養(yǎng)。培養(yǎng)前2周放入水中培養(yǎng)，于第3周時(shí)置于木村B半營養(yǎng)液中，于第4周開始時(shí)放入木村B全營養(yǎng)液中，將生長(zhǎng)4周的幼苗置于20%PEG-6000中模擬干旱脅迫，處理24 h，以不進(jìn)行干旱脅迫營養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗為對(duì)照(CK)。人工氣候箱白天溫度設(shè)定為29℃，夜間設(shè)定為24℃，14 h光照/12 h黑暗，光強(qiáng)為22 000 lx。脅迫結(jié)束后馬上取樣，取幼苗所有根，用鋁箔紙包好，放入液氮中迅速冷凍，然后于-80℃超低溫冰箱中保存，用于提取總RNA和測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，取樣時(shí)每個(gè)品種取一盤，每20株為一次重復(fù)。

本研究采用Affymetrix水稻表達(dá)譜芯片(GeneChip Rice Genome Array)分析干旱脅迫24 h后HEB07-2與巴西陸稻表達(dá)譜差異。芯片覆蓋了約51 279個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表兩個(gè)水稻亞種，48 564個(gè)粳稻亞種轉(zhuǎn)錄本和1260個(gè)秈稻亞種轉(zhuǎn)錄本。序列信息來源于GenBank mRNAs，TIGR基因預(yù)測(cè)和國際水稻基因組序列計(jì)劃。分析干旱脅迫24 h后雜草稻HEB07-2與巴西陸稻根系轉(zhuǎn)錄豐度的差異，通過計(jì)算雜交信號(hào)的比值和統(tǒng)計(jì)分析，獲得差異表達(dá)基因的信息，研究在功能或表達(dá)調(diào)控上具有相關(guān)性的基因。

1.2項(xiàng)目測(cè)定

1.2.1 葉片總RNA的提取

按Trizol試劑盒(康為公司，中國)說明書提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所抽RNA樣品的A260、A280值，根據(jù)測(cè)定的濃度，每個(gè)RNA樣品稀釋成相同濃度，取1 μg RNA用0.8%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2生理指標(biāo)測(cè)定

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

將HEB07-2和IAPAR9各樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以水稻Actin為內(nèi)參基因，采用QIAGEN公司的SYBR Green RT-PCR 試劑盒及ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。隨機(jī)選擇在HEB07-2和IAPAR9基因芯片檢測(cè)表現(xiàn)為差異表達(dá)的4個(gè)基因(LOC_Os03g37840，LOC_Os04g52390，LOC_Os08g32840，LOC_Os02g02400)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，以驗(yàn)證基因芯片的分析結(jié)果。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析所用的引物

Table 1. Primers used for real-time quantitative PCR.

基因Gene正向引物Forwardprimer(5'-3')反向引物Reverseprimer(5'-3')LOC_Os03g37840CGAAATAAGAAGGACGGATGGTGATGGGAGCAAGACAAAGGTALOC_Os04g52390TCAAGAACCAAAGTCAGATAGGAAGAAAGCACAATAAAGGTGACAACTAGLOC_Os08g32840CTCAACTACACCTACCGAAACGCTCCAACTTGTGCAGGAACTCATLOC_Os02g02400GAGGCAGAAGGCGACGATAGAGGTAGTTGACCCAGATGGCActinGGAACTGGTATGGTCAAGGCAGTCTCATGGATACCCGCAG

1.3數(shù)據(jù)處理

1.3.1芯片數(shù)據(jù)分析

本研究應(yīng)用MAS 5.0軟件(Affymetrix MicroArray Suite 5.0 software)分析掃描芯片上的每一基因的信號(hào)強(qiáng)度，之后利用GCOS(Affymetrix GeneChip Operating Software 4.0)建立每個(gè)樣品生物學(xué)重復(fù)內(nèi)擴(kuò)增樣品的信號(hào)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行信號(hào)的背景校正與數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化分析。進(jìn)而比較雜草稻與巴西陸稻干旱脅迫下兩種背景的基因表達(dá)譜的變化。進(jìn)一步采用Gene Spring 7.1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的均值來計(jì)算每個(gè)探針的表達(dá)變化。用t檢驗(yàn)(one-way)篩選差異顯著基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異兩倍的探針位點(diǎn)，方差分析的顯著性差異為0.005。

1.3.2生理數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。每個(gè)供試材料不同處理間進(jìn)行方差分析(ANOVA)，采用Duncan法(P<0.05，0.01)以0 h數(shù)據(jù)為對(duì)照。利用GraphPad Prism 6作圖。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析

各樣品每個(gè)基因重復(fù)3次，按相對(duì)定量法進(jìn)行定量計(jì)算，目的基因相對(duì)定量計(jì)算公式為Rel.Exp=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct未知樣品-△CtCalibrator，△Ct未知樣品=Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因，△CtCalibrator=Ct參比樣內(nèi)參基因-Ct參比樣目的基因。

2　結(jié)果與分析

2.1HEB07-2和巴西陸稻差異基因倍數(shù)變化及表達(dá)模式

雜草稻HEB07-2與巴西陸稻分別有6878個(gè)和2923個(gè)基因表達(dá)，根據(jù)RICE芯片的詮釋可知，在干旱脅迫下HEB07-2表達(dá)的基因中5410個(gè)基因有明確功能注釋，1468個(gè)基因無確定功能，占21.3%；巴西陸稻干旱脅迫下表達(dá)的基因中，2076個(gè)基因有確定功能，847個(gè)基因無明確功能注釋，占表達(dá)基因總數(shù)的29.0%；2個(gè)供試材料差異表達(dá)基因有6579個(gè)，其中4799個(gè)基因功能已知，1780個(gè)表達(dá)基因無明確注釋，占總數(shù)的27.1%。

HEB07-2和巴西陸稻表達(dá)重疊的基因有1329個(gè)。其中HEB07-2受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)的基因有4693個(gè)，下調(diào)的基因有2185個(gè)。而巴西陸稻受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)基因遠(yuǎn)小于HEB07-2，有983個(gè)，受干旱脅迫下調(diào)的基因與HEB07-2相當(dāng)，有1940個(gè)。上調(diào)的最大倍數(shù)在44.2到58.4倍之間，平均變化2.9～3.4倍；下調(diào)最大倍數(shù)在20.6～167.5倍，平均下調(diào)2.9～5.3倍。干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻相比有差異表達(dá)的基因數(shù)量為6579個(gè)，無差異的基因有48 246個(gè)，其中有2546個(gè)基因下調(diào)，4033個(gè)基因上調(diào)。

2.2干旱脅迫下HEB07-2根系差異表達(dá)基因GO分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO (GENE ONTOLOGY)分析，按照GO分類法則，對(duì)差異基因進(jìn)行功能分類。干旱脅迫處理下，HEB07-2與對(duì)照比發(fā)生變化的基因，經(jīng)過GO分析后按分子功能、生物過程和細(xì)胞組成進(jìn)行詮釋(詳見在線輔助性表S1，http://www.ricesci.cn/)，涉及分子功能基因有2841個(gè)，這些基因涉及陽離子結(jié)合、離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、DNA結(jié)合、鐵離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合、四吡咯結(jié)合亞鐵血紅素結(jié)合、碳水化合物結(jié)合、維生素結(jié)合、糖結(jié)合、磷酸吡哆醛結(jié)合、維生素B6結(jié)合、糖脂類結(jié)合，分別占14.5%、14.5%、13.3%、7.2%、3.6%、2.8%、2.4%、2.4%、1.0%、0.9%、0.8%、0.8%、0.8%、0.12%；此外，還有蛋白激酶活性、蛋白組氨酸/絲氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、電子載體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、氧化還原酶活性、幾丁質(zhì)酶活性、脂氧合酶活性、半胱氨酸活性、谷氨酸脫羧酶活性、糖脂轉(zhuǎn)運(yùn)器活性，各占5.5%、4.8%、4.2%、3.6%、3.1%、1.0%、0.3%、0.2%、0.2%、0.1%、0.1%。

圖1HEB07-2和IAPAR9響應(yīng)干旱脅迫基因比較的韋恩圖

Fig. 1. Ven figure of HEB07-2 and IAPAR9 regulated genes under drought.

圖2HEB07-2和IAPAR9干旱脅迫誘導(dǎo)和抑制的基因

Fig. 2. Gene numbers of HEB07-2 and IAPAR9 induced and repressed by drought.

按生物過程分有1286個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了變化，這些基因的功能包括代謝過程(RNA代謝調(diào)節(jié)過程、脂質(zhì)合成過程、氨基酸衍生物代謝等)、轉(zhuǎn)錄(轉(zhuǎn)錄調(diào)控等)、蛋白氨基酸磷酸化、氧化還原、轉(zhuǎn)運(yùn)(金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)等)、光合捕光、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及定位、響應(yīng)(水響應(yīng)等)，分別占總數(shù)的12.2%、14.1%、5.5%、5.0%、1.7%、0.2%、0.7%、0.5%。

按細(xì)胞組成分有1283個(gè)基因表達(dá)發(fā)生了變化，主要是細(xì)胞器(膜結(jié)合細(xì)胞器、非膜結(jié)合細(xì)胞器)、細(xì)胞、蛋白復(fù)合體(泛素連接酶復(fù)合體)、細(xì)胞外區(qū)域(胞外區(qū)域和質(zhì)外體)，分別占24.1%、13.1%、0.5%、2.3%。

2.3干旱脅迫下巴西陸稻根系差異基因GO分析

干旱脅迫下，巴西陸稻根系與對(duì)照比基因組發(fā)生表達(dá)變化，經(jīng)GO分析后，涉及分子功能的基因共有1059個(gè)，包括離子結(jié)合(陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合等)、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、激酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性、氧化還原酶活性，所占比例分別為46.1%、12.2%、10.4%、6.0%、3.0%、1.2%。干旱脅迫期間和生物過程相關(guān)的基因共有505個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，這些基因涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、代謝過程、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、響應(yīng)反應(yīng)，所占比例分別為18.9%、8.9%、8.7%、1.2%。按細(xì)胞組成分，發(fā)生表達(dá)的基因有512個(gè)，基因功能涉及細(xì)胞組成(細(xì)胞膜、細(xì)胞壁)、細(xì)胞器(膜結(jié)合細(xì)胞器，非膜結(jié)合細(xì)胞器)、細(xì)胞外區(qū)域，所占比例分別為13.6%、23.2%、1.3%(詳見在線輔助性表S2，http://www.ricesci.cn/)。

表 2HEB07-2和IAPAR9差異表達(dá)基因數(shù)及倍數(shù)變化

Table 2. Up- and down-regulated fold of genes in HEB07-2 and IAPAR9.

材料Material下調(diào)表達(dá)基因Down-regulatedgene下調(diào)個(gè)數(shù)No.ofdown-regulatedgene最大Max平均Average上調(diào)表達(dá)基因Up-regulatedgene上調(diào)個(gè)數(shù)No.ofup-regulatedgenes最大Max平均Average未變個(gè)數(shù)Nochange樣品19/樣品1Sample19/Sample1218584.64.3469358.43.447947樣品20/樣品2Sample20/Sample2194020.62.998344.22.951902

樣品1為HEB07-2正常條件下樣品，樣品19為HEB07-2干旱處理后樣品；樣品2為巴西陸稻正常條件下樣品，樣品20為巴西陸稻干旱處理后樣品。

Sample 1 is from HEB07-2 under normal condition, sample 19 is collected from HEB07-2 under drought, Sample 2 is from IAPAR9 under normal condition, sample 20 is collected from IAPAR9 under drought treatment.

圖3干旱脅迫下HEB07-2和IAPAR9差異表達(dá)倍數(shù)分布

Fig. 3. Change folds of HEB07-2 and IAPAR9 under drought condition.

2.4干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻根系差異表達(dá)基因GO分析

干旱脅迫下，對(duì)HEB07-2與巴西陸稻根系差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析后可知(詳見在線輔助性表S3，http://www.ricesci.cn/)，共有4799個(gè)已知功能基因表達(dá)，其中涉及分子功能的基因共有2248個(gè)，包括離子結(jié)合 、DNA連接、血紅素結(jié)合、葉綠體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控子活性、電子載體活性及酶活性，分別占46.7%、7.4%、5.9%、2.0%、12.0%、3.9%、1.1%。

生物過程方面已知功能的差異基因有974個(gè)，涉及轉(zhuǎn)錄、氧化還原、防御反應(yīng)、光合作用、蛋白質(zhì)泛素化、胞外分泌、代謝過程、植物型細(xì)胞壁組織、蛋白質(zhì)發(fā)色團(tuán)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及定位，分別占18.1%、5.3%、2.2%、2.5%、0.6%、0.4%、3.7%、0.3%、0.2%、0.8%。

涉及細(xì)胞組成有功能的差異基因有1577，功能涉及細(xì)胞器(囊泡、質(zhì)體、葉綠體等)、細(xì)胞組成(細(xì)胞膜、細(xì)胞壁)、胞外區(qū)域、光合系統(tǒng)(光系統(tǒng)Ⅰ、光系統(tǒng)Ⅱ)、泛素連接酶復(fù)合體、細(xì)胞皮層及鞭毛，所占比例分別為23.7%、24.2%、2.4%、2.8%、0.5%、1.8%。

2.5干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻根系響應(yīng)基因的染色體定位

為了分析干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻根系響應(yīng)基因在水稻染色體上的分布，我們比較了供試材料在干旱脅迫下總響應(yīng)基因及誘導(dǎo)、抑制基因在各染色體上的分布個(gè)數(shù)(圖4)。結(jié)果表明，HEB07-2總響應(yīng)基因在各染色體上分布個(gè)數(shù)從多到少排序依次為第1、3、2、5、6、4、7、8、11、12、10和9染色體。其中，第1、3、2、5、4染色體上受干旱脅迫抑制基因多于受脅迫誘導(dǎo)基因，而這幾條染色體也是總響應(yīng)基因最多的幾條染色體；其余染色體上受干旱脅迫誘導(dǎo)基因數(shù)量大于受干旱脅迫抑制基因的數(shù)量，這幾條染色體上總響應(yīng)基因數(shù)量小于其他染色體。而巴西陸稻在干旱脅迫下染色體上總響應(yīng)基因數(shù)量在各染色體上分布個(gè)數(shù)從多到少排序依次是第1、3、2、5、6、4、7、11、8、9、12、10染色體。除第6、11染色體外，巴西陸稻其他染色體上均是受干旱抑制的基因數(shù)量多于誘導(dǎo)基因數(shù)量。在未知功能基因中HEB07-2受干旱脅迫誘導(dǎo)的基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于受干旱脅迫抑制的基因數(shù)量，而巴西陸稻則是受抑制的基因數(shù)量遠(yuǎn)大于受誘導(dǎo)的數(shù)量(圖5)。

2.6干旱脅迫下HEB07-2和巴西陸稻表型和根系生理變化

由圖6-A～B可知，干旱脅迫下IAPAR9根系超氧陰子產(chǎn)生速率和丙二醛含量顯著提高，與對(duì)照比達(dá)到極顯著水平，而HEB07-2上升幅度小，說明根系受傷害程度輕。干旱脅迫下HEB07-2根系可溶性糖含量顯著增高，與對(duì)照差異極顯著。

由圖6-D～F可知干旱脅迫下HEB07-2根系超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性顯著增高，而IAPAR9只有過氧化物酶活性顯著增大。

圖6-G～I(xiàn)顯示干旱脅迫下HEB07-2根系抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、脫氧抗壞血酸還原酶活性均顯著增高，且抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶增高幅度都大于IAPAR9。

A, HEB07-2; B, IAPAR9.

圖4HEB07-2和IAPAR9干旱脅迫下響應(yīng)基因染色體分布

Fig. 4. Distribution of regulated genes on rice chromosome under drought stress.

圖5HEB07-2和IAPAR9響應(yīng)干旱脅迫的未知基因數(shù)

Fig. 5. Unknow genes of HEB07-2 and IAPAR9 under drought stress.

2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)準(zhǔn)確與否，隨機(jī)選取HEB07-2和IAPAR9中表達(dá)發(fā)生變化的4個(gè)基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。其中，2個(gè)基因與抗氧化物酶相關(guān)，為L(zhǎng)OC_Os08g32840、LOC_Os02g02400；2個(gè)基因與鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，為L(zhǎng)OC_Os03g37840、LOC_Os04g52390。結(jié)果如圖8-A～B所示，在HEB07-2的實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果中，LOC_Os03g37840和LOC_Os04g52390略低于芯片分析的結(jié)果，LOC_Os08g32840和LOC_Os02g02400結(jié)果高于芯片分析的結(jié)果；在IAPAR9中，LOC_Os08g32840、LOC_Os02g02400的實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果略高于芯片分析的結(jié)果，LOC_Os03g37840、LOC_Os04g52390結(jié)果低于芯片分析的結(jié)果。從幾個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)來看，實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果與基因芯片分析結(jié)果基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。證明芯片分析結(jié)果是可靠的。

3　討論

近年來研究人員利用表達(dá)譜技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等在鑒定植物耐旱基因方面做了大量工作[10,11, 14-18]。侯欣等[17]利用基因芯片篩選到了一個(gè)候選基因OsSKIP，轉(zhuǎn)入該基因的水稻幼苗在缺水條件下生存能力明顯增強(qiáng)。熊立仲等[18]在水稻中鑒定了一個(gè)控制水稻葉片蠟質(zhì)積累的基因DWA1，缺失該基因的dwa1突變體對(duì)干旱十分敏感。在本研究中，雜草稻以基因表達(dá)量上調(diào)這種主動(dòng)的調(diào)控形式來避害，而巴西陸稻的負(fù)調(diào)控水平高于正向的調(diào)控則表明其避害的方式與雜草稻可能存在本質(zhì)的區(qū)別。從脅迫后的兩種類型水稻生理指標(biāo)與生長(zhǎng)指標(biāo)角度分析，雜草稻HEB07-2對(duì)于干旱脅迫有更強(qiáng)的耐受程度，其響應(yīng)程度體現(xiàn)出了生物學(xué)效應(yīng)與遺傳學(xué)效應(yīng)，是一類可以應(yīng)用于抗旱遺傳改良的優(yōu)異種質(zhì)資源。干旱脅迫下兩種抗旱類型水稻重疊的轉(zhuǎn)錄本的比例較小，表明稻屬植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的機(jī)制十分復(fù)雜。值得一提的是，從遺傳背景角度分析，雜草稻HEB07-2具有古老粳稻的基因組遺傳組成，而巴西陸稻屬于具有較高秈稻血緣的外來粳稻品種。因此，這種遺傳背景的差異同樣可以在表達(dá)譜中體現(xiàn)出來。

圖6干旱脅迫下HEB07-2和IAPAR9根系生理指標(biāo)變化

Fig. 6. The physiological index change in HEB07-2 and IAPAR9 under drought condition.

干旱脅迫下HEB07-2生物過程相關(guān)基因中表達(dá)數(shù)量最多的幾類基因涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控(215個(gè))、轉(zhuǎn)錄(116個(gè))、依據(jù)DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(122個(gè))、RNA代謝(122個(gè))、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)(40個(gè))。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，由轉(zhuǎn)錄因子控制的基因會(huì)對(duì)環(huán)境做出應(yīng)答。Ali Moumeni等[19]研究表明在干旱脅迫中有2336個(gè)基因表達(dá)發(fā)生變化，其中1461個(gè)基因來自于轉(zhuǎn)錄因子基因家族，占變化基因總數(shù)的62.5%。本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下雜草稻差異表達(dá)基因中，轉(zhuǎn)錄家族基因也占很大比例，這有利于提高植物的耐旱性[20]。本研究中，離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)數(shù)量也較多，其中鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)幅度較大，LOC_Os03g37840上調(diào)表達(dá)8.3倍、LOC_Os04g52390上調(diào)表達(dá)3.8倍，鉀是植物體內(nèi)活細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝的重要陽離子，一切生理生化反應(yīng)差不多都有鉀參加，是植物需要最多的陽離子，它能夠促進(jìn)根系吸水，提高植物水分利用效率，并能夠活化多種酶，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，從而提高氮素的利用率，所以干旱脅迫下鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，有利于植物體內(nèi)鉀離子的積累，提高水分利用效率，促進(jìn)功能蛋白合成，提高肥料利用效率，從而幫助植物渡過逆境脅迫[21-24]。除此以外，涉及細(xì)胞過程相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)的還有幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因、次生代謝過程相關(guān)基因、細(xì)胞氨基酸衍生物合成相關(guān)基因。這些基因的表達(dá)與HEB07-2和巴西陸稻相應(yīng)的抗旱生理指標(biāo)可以很好地印證。因此，這些生物過程相關(guān)基因?qū)τ陔s草稻抗旱具有重要的貢獻(xiàn)。

圖7干旱脅迫下HEB07-2和IAPAR9表型變化

Fig. 7. Phenotype of HEB07-2 and IAPAR9 under drought condition.

A, HEB07-2; B, IAPAR9; 1, LOC_Os03g37840; 2, LOC_Os04g52390; 3, LOC_Os08g32840; 4, LOC_Os02g02400.

圖8HEB07-2和IAPAR9實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)的比較

Fig. 8. Comparison of microarray data with real-time PCR results in HEB07-2 and IAPAR9.

干旱脅迫下雜草稻HEB07-2涉及最多的細(xì)胞組成差異表達(dá)基因?yàn)槟は到y(tǒng)組成相關(guān)基因(184個(gè))、內(nèi)在膜蛋白(187個(gè))、細(xì)胞質(zhì)囊泡(193個(gè))以及細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合囊泡(193個(gè))等。本研究發(fā)現(xiàn)，雜草稻之所以能很好地抵御干旱脅迫，保持膜系統(tǒng)的完整性是其中最重要的原因之一。這與基因組表達(dá)譜高度吻合，這種吻合性也同樣體現(xiàn)在細(xì)胞壁的合成上。研究表明幾丁質(zhì)是植物細(xì)胞壁重要組成部分，干旱脅迫可以通過影響幾丁質(zhì)代謝進(jìn)而影響植物細(xì)胞壁的合成，而在幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)上雜草稻HEB07-2同樣體現(xiàn)出很高的正向調(diào)控水平。因此，這些細(xì)胞組成相關(guān)基因?qū)τ陔s草稻出眾的抗旱能力有著很好的解釋。

干旱脅迫期間，HEB07-2有關(guān)分子功能差異基因，主要有離子結(jié)合(466個(gè))、金屬離子結(jié)合(428個(gè))、蛋白激酶活性(178個(gè))、蛋白質(zhì)絲氨酸/組氨酸激酶活性(154個(gè))、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性(136個(gè))、電子載體活性等。其中，金屬離子結(jié)合、電子載體活性與氧化還原酶合成有關(guān)，這些基因的表達(dá)有利于提高擬南芥耐旱和耐高溫的能力[25]，以及水稻對(duì)長(zhǎng)期干旱脅迫的適應(yīng)[26]。本研究表明，質(zhì)膜較高的抗氧化能力是雜草稻耐旱的重要原因，這一過程中相關(guān)的酶活性提高是關(guān)鍵所在，干旱脅迫促使HEB07-2超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的活性上升，維持活性氧代謝平衡，提高抗旱能力，同樣在表達(dá)譜中與氧化還原相關(guān)基因的表達(dá)水平處于非常突出的地位。

巴西陸稻在干旱脅迫下涉及生物過程的基因主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控(126個(gè))、依賴DNA的轉(zhuǎn)錄控制(74個(gè))、RNA代謝調(diào)控過程(74個(gè))、轉(zhuǎn)錄(53個(gè))、離子轉(zhuǎn)運(yùn)(34個(gè))。其下調(diào)表達(dá)基因主要有鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)、谷氨酸家族氨基酸代謝過程、細(xì)胞氨基酸合成過程。干旱脅迫下鉀離子通道蛋白基因表達(dá)受抑，說明干旱脅迫在一定程度上影響了巴西陸稻細(xì)胞內(nèi)鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)，加劇了細(xì)胞的滲透脅迫，導(dǎo)致干旱損傷。同時(shí)干旱脅迫導(dǎo)致細(xì)胞氨基酸合成減少，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能，這也是干旱損傷的表現(xiàn)。生物過程中上調(diào)表達(dá)的主要與抵抗細(xì)菌的基因相關(guān)，屬于OsPR4家族，受干旱脅迫等非生物脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)OsPR4家族基因有利于植物提高耐旱性[27]。巴西陸稻細(xì)胞組成相關(guān)基因發(fā)生表達(dá)變化的主要涉及內(nèi)在膜蛋白(81個(gè))、膜完整性(79個(gè))、細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合囊泡(78個(gè))等。其中上調(diào)表達(dá)涉及的基因有胞外區(qū)域調(diào)節(jié)基因，下調(diào)表達(dá)的基因主要有細(xì)胞壁。有研究表明輕度干旱脅迫下根系仍能維持生長(zhǎng)[28]，在本研究中涉及細(xì)胞壁合成的幾個(gè)基因中，CSLC-1(LOC_Os01g56130)、XG_FTase(LOC_Os06g10980)上調(diào)表達(dá)，而CSLE-6(LOC_Os09g30130)、XG_FTase(LOC_Os02g52640)、CSLA-9(LOC_Os06g42020)、CSLC2(LOC_Os09g25900)均下調(diào)表達(dá)。眾多研究表明CslA亞家族編碼(1,4)-β-D-甘露聚糖合成酶，而CslC-1家族編碼(1,4)-β-D-葡聚糖合成，其是木葡聚糖的骨架組成部分[29-31]。較低的細(xì)胞水勢(shì)使玉米根系木葡聚糖活性上升，是為維持根系在脅迫條件下的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下巴西陸稻根系與細(xì)胞壁合成相關(guān)基因既有上調(diào)表達(dá)又有下調(diào)表達(dá)，但以下調(diào)表達(dá)為主，說明干旱已經(jīng)影響了其細(xì)胞壁的合成，是遭受干旱脅迫傷害的一種表現(xiàn)。巴西陸稻涉及分子功能的基因發(fā)生表達(dá)變化的主要有離子結(jié)合(203個(gè))、DNA結(jié)合(123個(gè))、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性(80個(gè))、轉(zhuǎn)錄因子活性(59個(gè))、特異序列DNA結(jié)合(41個(gè))等。大多以下調(diào)表達(dá)為主，涉及碳水化合物激酶活性、鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、氧化還原酶活性等。這些都說明與雜草稻相比巴西陸稻易受干旱脅迫的危害。

HEB07-2與巴西陸稻干旱脅迫下響應(yīng)途徑的差異表現(xiàn)為HEB07-2在鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)、次生物質(zhì)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖代謝、跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)器活性、亞鐵血紅素結(jié)合體、氧化還原酶活性等方面基因顯著上調(diào)。研究結(jié)果表明控制SOD(LOC_Os07g46990)、POD(LOC_Os01g18970)、CAT(LOC_Os02g02400)、APX(LOC_Os07g49400)、MDHAR(LOC_Os08g32840)、GR(LOC_Os02g56850)酶活性的基因與巴西陸稻比分別上調(diào)表達(dá)1.9倍、6.43倍、5.20倍、2.39倍、6.07倍、1.14倍，這與生理研究結(jié)果一致，即干旱脅迫下雜草稻抗氧化酶活性更高，能夠及時(shí)清除ROS，保持細(xì)胞內(nèi)ROS代謝平衡，減輕干旱脅迫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的傷害，表明HEB07-2與巴西陸稻比在生理生化代謝方面更適應(yīng)干旱脅迫。前人研究表明干旱脅迫下耐旱品種抗氧化酶系基因表達(dá)顯著上調(diào)[19]，與本研究結(jié)果一致。維持植物根系在干旱脅迫下的生長(zhǎng)十分重要，這需要協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)眾多過程[32]。本研究結(jié)果表明HEB07-2和巴西陸稻比關(guān)于細(xì)胞生長(zhǎng)(cell growth)的差異表達(dá)基因有29個(gè)，平均上調(diào)4.1倍，這說明在干旱脅迫下HEB07-2根系受到脅迫較輕，有更強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)，耐旱性強(qiáng)于巴西陸稻，這與Bartels研究[28]結(jié)果一致。此外，HEB07-2與鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)活性也顯著高于巴西陸稻，這有利于提高HEB07-2的水分利用率及滲透調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而提高耐旱能力。

本研究通過對(duì)干旱脅迫后北方雜草稻HEB07-2與巴西陸稻表達(dá)譜的比較研究，對(duì)不同稻屬植物的抗旱分子機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。另外，本研究雖然對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO分析，但仍然缺乏系統(tǒng)解析不同基因家族對(duì)于雜草稻在更高抗旱水平上的表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)，這有待于進(jìn)一步研究。

水稻抗旱的分子機(jī)制被普遍認(rèn)為是所有非生物脅迫中最復(fù)雜的，雖然前人有過許多正向遺傳學(xué)研究的嘗試，也取得了一定的進(jìn)展，然而并沒有克隆到主效的抗旱相關(guān)基因。關(guān)于水稻耐旱反向遺傳學(xué)的研究也有一定的進(jìn)展，但鑒定到的抗旱位點(diǎn)很難確定遺傳效應(yīng)，在不同的遺傳背景或不同的生物學(xué)重復(fù)中很難重復(fù)。鑒于抗旱稻屬植物分子遺傳機(jī)制的復(fù)雜性，在今后的研究中將正向遺傳學(xué)與反向遺傳學(xué)相互結(jié)合，即對(duì)可以定位到數(shù)量性狀基因座中具有大的遺傳貢獻(xiàn)的表達(dá)差異位點(diǎn)進(jìn)行著重分析，有望大大簡(jiǎn)化抗旱分子遺傳機(jī)制的復(fù)雜程度，定位、克隆到可以在育種中應(yīng)用的具有遺傳效應(yīng)的主效基因。

在線輔助信息：有3個(gè)在線輔助性表S1、S2和S3放在中國水稻科學(xué)網(wǎng)站上，網(wǎng)址為http://www.ricesci.cn/。

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Global Genome Expression Analysis of Root Genes under Drought Stress in Weedy Rice and Up-land Rice

DING Guo-hua1,2,#, SUN Jian2,#, YANG Guang3, ZHANG Feng-ming1, BAI Liang-ming1, SUN Shi-chen1, JIANG Shu-kun1, WANG Tong-tong1, ZHENG Hong-liang1, XIA Tian-shu1, SHEN Xi-hong4, MA Dian-rong2, *, CHEN Wen-fu2,*

(1Postdoctoral Scientific Research Station of HAAS/Cultivation and Farming Research Institute of HASS/ Northern Japonica Rice Molecular Breeding Joint Research Center, Harbin 150086, China；2Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China；3Institute of Economic Crop of Liaoning, Liaoyang 111000, China；4China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China；#These authors contributed equally to this work；*Corresponding author, E-mail： madianrong@163.com， wfchen5512@126.com)

The expression changes of root genes in drought-resistance weedy rice HEB07-2 (Oryzasativaf.spontanea) and up-land rice IAPAR9 (Oryzasativa) were analyzed under polyethylene glycol(PEG)-simulated with drought stress condition with Affymetrix GeneChip rice genome array. The results indicated that the extent and direction of transcriptome response of HEB07-2 and IAPAR9 to drought differed greatly. For HEB07-2, among 6878 expressed genes, 4693 were up-regulated and 2185 were down-regulated under drought condition. For IAPAR9, among 2923 expressed genes,983 were up-regulated and 1940 were down-regulated. Analysis of differentially expressed genes in HEB07-2 and IAPAR9 showed that the weedy rice HEB07-2 had a higher changing fold than the up-land rice IAPAR9. Gene ontology analysis revealed that genes of HEB07-2 in potassium ion transporting(GO： 0006813), secondary metabolite(GO： 0019748), cell growth(GO： 0016049), glucose metabolism(GO：0006006), transmembrane ion transporter activity(GO：0015075), ferroheme coalition(GO：0020037), oxidordeuctase activity(GO：0016491)were significantly up-regulated in comparing with IAPAR9. These were consistent with the physiological and phenotypic data.

weedy rice; root; gene expression profiling; drought resistance

2015-12-09； 修改稿收到日期: 2016-01-23。

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站；哈爾濱市科技局項(xiàng)目(2014RFQYJ125)；黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2014QN006)；黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士人員科研啟動(dòng)金項(xiàng)目(201507-16)；國家水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-01-43); 北方寒地粳稻資源研究與新品種選育項(xiàng)目(2014BAD01B03-02)。

Q786; Q945.78

A

1001-7216(2016)05-0458-11

丁國華， 孫健， 楊光, 等. 干旱脅迫下雜草稻和栽培稻根系基因表達(dá)差異研究. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(5)： 458-468.