李 瑋　艾東旭　李蓮瑞

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾市 843300)(2 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾市 843300)(3 新疆兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實驗室， 新疆 阿拉爾市 843300)

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和田黑雞淋巴細(xì)胞的分離和總RNA提取

李 瑋1艾東旭1李蓮瑞2,3*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾市 843300)(2 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾市 843300)(3 新疆兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實驗室， 新疆 阿拉爾市 843300)

探討和田黑雞淋巴細(xì)胞最佳分離條件和淋巴細(xì)胞總RNA提取方法，為和田黑雞淋巴細(xì)胞的免疫學(xué)研究提供最為有效的實驗材料。采用離心法分離雞外周血淋巴細(xì)胞并檢測淋巴細(xì)胞活力。利用Trizol法提取和田黑雞的外周血淋巴細(xì)胞總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳對所提取的RNA進(jìn)行檢測，并用核酸測定儀測定總RNA。結(jié)果表明：使用1:1比例的無Ca2+、Mg2+-Hank’S稀釋液稀釋抗凝血后，在室溫、2 000 rpm/min、35 min的條件下離心分離所得的淋巴細(xì)胞效果最好。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示出28S、18S和5.8S三條帶，使用核酸測定儀測定的總RNA的OD260/280值為1.996，濃度為283 μg/ml，表明提取了高質(zhì)量的總RNA，為開展后續(xù)的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

和田黑雞； 淋巴細(xì)胞； 總RNA

和田黑雞，又稱“尼雅黑雞”或“洛浦黑雞”，是和田一種古老、獨(dú)特的優(yōu)良肉蛋兼用型地方品種，具有抗逆抗病性強(qiáng)、耐粗飼、抗高溫等特點(diǎn)[1]。地方居民現(xiàn)今依然采用傳統(tǒng)粗放散養(yǎng)的方式，使其保持了良好的生產(chǎn)性能，和沙漠腹地典型的綠色生態(tài)本質(zhì)。和田黑雞于2010年被列為國家級保護(hù)名錄，截至2010年底，洛浦縣共有和田黑雞8. 6萬羽[2]，主要分布在杭桂鄉(xiāng)、洛浦鎮(zhèn)、阿其克鄉(xiāng)、恰爾巴格鄉(xiāng)等地，均為農(nóng)牧民散養(yǎng)，品種和數(shù)量在不斷降低，如何提高黑雞的飼養(yǎng)管理水平及開發(fā)利用，提高其經(jīng)濟(jì)利用價值，使和田黑雞這一珍貴的家禽在數(shù)量、質(zhì)量上得到提高，是擺在我們面前的重要任務(wù)[3]。我國和田黑雞現(xiàn)處于保種維持狀態(tài)，根據(jù)目前我國的狀況，和田黑雞的存在和發(fā)展成為至關(guān)重要的問題。國內(nèi)的相關(guān)研究較少，僅對和田黑雞的血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定；國外的研究主要針對地方品種參與免疫應(yīng)答的組織和器官[4,5]。目前和田黑雞具有較好的發(fā)展前景及研究價值。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

和田黑雞全血，無鈣、鎂Hank’s液、5%枸櫞酸鈉溶液、2%臺盼藍(lán)染液、雞淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；電子天平(BS124S)；超凈工作臺(SW-CJ-2F型)；渦漩混合器(TDL-60B)；低速臺式離心機(jī)(TDL-5)；高速臺式冷凍離心機(jī)(Neofuge15R型)；全自動攝影生物顯微鏡(DP70+B10-olysLIA)；-70 ℃超低溫冰柜(DN-HW328E)；電泳槽(DYCZ-28A)；電腦三恒多用電泳儀(DYY-60C型)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon-4100)；核酸蛋白測定儀(Bio Drop)。

1.2采血

8月齡的和田黑雞活體，心臟采血法抽取10 mL和田黑雞心臟血液，添加2 mL 4%枸櫞酸鈉溶液抗凝劑。

1.3淋巴細(xì)胞的分離

取10 mL新鮮抗凝血與無Ca2+、Mg2+Hank’s液按1:1稀釋，緩慢上下傾斜混勻(避免劇烈振蕩，細(xì)胞破裂)；干凈試管中加入2 ml雞淋巴細(xì)胞分離液，用移液槍吸取2 ml稀釋抗凝血，沿試管壁緩慢注入其中，注意不破壞分離界面即可；2 000 rpm/min離心35 min后；小心吸取淋巴細(xì)胞層加入5倍體積無Ca2+、Mg2+Hank’s液，洗滌2～3次，每次4 ℃，1 500 rpm/min，離心20 min，最終得到較純的淋巴細(xì)胞。

1.4淋巴細(xì)胞活力檢測

取50 μL淋巴細(xì)胞懸液滴加在細(xì)胞計數(shù)板上，加入50 μL新鮮臺盼藍(lán)染液，充分混勻，5～10 min內(nèi)于顯微鏡下觀察。細(xì)胞活力檢測：活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。

1.5總RNA提取

取600 μL淋巴細(xì)胞，加入1 mL Trizol上下顛倒十次混勻后，室溫靜置30 min；加入200 μL氯仿，渦旋15 s，靜置2 min，12 000 rpm離心15 min；取上清置于新的離心管中，隨后加入500 μL異丙醇，室溫孵化10 min，12 000 rpm離心10 min，用槍小心棄去上清液，加入75%乙醇1 mL，渦旋混勻，4 ℃，7 500 rpm離心5 min，再次棄去上清，吸干其沉淀表面液體，超凈臺中室溫干燥5～10 min；最后加入30～60 μL的DEPC水溶解RNA，55 ℃～60 ℃水浴10 min，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6RNA鑒定

1.6.1完整性鑒定：取RNA樣品10 μL，采用1%普通瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照，記錄鑒定結(jié)果。

1.6.2純度鑒定：取2 μL的RNA樣品，加入48 μL的DEPC水，充分混勻后注入微量比色杯中，用核酸分析儀測定RNA 的濃度和純度。

2　結(jié)果與分析

2.1淋巴細(xì)胞分離結(jié)果

無Ca2+、Mg2+Hank’S稀釋液、抗凝血和淋巴細(xì)胞分離液用1：1：1比例添加，離心后分層，層面分界更清晰(圖1)。自上而下：第一層為血漿層；第二層很薄且呈白霧狀為淋巴細(xì)胞層；第三層無色透明為離液層；第四層為深紅色紅細(xì)胞層，呈薄霧狀的粒細(xì)胞附于紅細(xì)胞表面。

圖1　和田黑雞外周血淋巴細(xì)胞分離結(jié)果

2.2淋巴細(xì)胞活力檢測結(jié)果

取分離好的淋巴細(xì)胞懸液滴加在細(xì)胞計數(shù)板上，加50 ml新鮮臺盼藍(lán)染液，充分混勻，5～10 min內(nèi)在顯微鏡下觀察結(jié)果(見圖2)。分別對活細(xì)胞和死細(xì)胞計數(shù)，按公式活細(xì)胞百分率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，得到淋巴細(xì)胞的存活率為93. 1%。

圖2　和田黑雞淋巴細(xì)胞臺盼藍(lán)染色結(jié)果(10×100)

2.3淋巴細(xì)胞RNA提取結(jié)果

RNA完整性鑒定：1%普通瓊脂糖凝膠電泳分離的總RNA，凝膠成像系統(tǒng)拍照可見28S、18S及5.8S 3條清晰條帶(見圖3)。

圖3　淋巴細(xì)胞RNA提取結(jié)果

RNA純度鑒定：使用核酸蛋白測定儀對提取的總RNA的純度進(jìn)行檢測，結(jié)果為OD260/230值為2. 134，OD260/280為1. 945。

3　討論

3.1本實驗采用簡便易操作的Ficoll-U rografin(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度離心法分離和田黑雞外周血淋巴細(xì)胞，關(guān)鍵步驟是分層離心時采用20～25 ℃，2 000 rpm/min，35 min，可見離心管內(nèi)分為四層，分離得到淋巴細(xì)胞活性和純度高，與謝昆、蔣成硯等[6]雞淋巴細(xì)胞分離的結(jié)果基本一致。3.2實驗過程中發(fā)現(xiàn)影響著淋巴細(xì)胞分離效果有很多因素。首先需要收集足量的新鮮和田黑雞外周血液，此外，分離時采用的分離液的濃度、離心力、離心時間、溫度以及實驗中的操作[7]手法都會影響分離結(jié)果。

操作中收集存放血樣時選擇帶有蓋子的試管，上下傾斜4～5次，輕緩的使血液與抗凝劑充分結(jié)合，避免抗凝不完全或溶血現(xiàn)象；其次加液時，需做到貼壁輕緩的注入，穩(wěn)定快速的完成，以避免時間過長導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡；將得到的淋巴細(xì)胞洗滌2～3次后純度較高。

3.3本實驗采用Trizol法提取RNA。經(jīng)過多組試驗，提取的RNA純度有時并不高，有時僅出現(xiàn)抹帶，有時會出現(xiàn)基因組。由此得出，加入Trizol的量與裂解淋巴細(xì)胞的時間要充分。

使用電泳判斷RNA的完整性。理論上，完整RNA的28S:18S的比例在2. 6:1左右 (即分子量之比)，然而由于較大分子量的RNA更容易降解，當(dāng)28S有相當(dāng)程度的降解時，18S(包括mRNA)卻相當(dāng)完整，故大部分資料中強(qiáng)調(diào)28S:18S的比例為2:1時，總RNA的質(zhì)量較高[8]。本實驗中電泳結(jié)果顯示RNA幾乎達(dá)到2:1的比例，說明從和田黑雞淋巴細(xì)胞中提取的總RNA完整性較高。。

使用核酸測定儀測定總RNA的純度，結(jié)果顯示OD260/280在1. 7～2. 0之間時表明RNA 純度高，如果小于1. 7，則說明有蛋白質(zhì)的污染或是RNA 發(fā)生降解；同時測定OD260/230的比值，結(jié)果大于2. 0時RNA純度高，反之如果遠(yuǎn)小于2. 0，則說明RNA樣品中有大量的小分子或鹽的存在[9]。本實驗以和田黑雞外周血淋巴細(xì)胞為原料，利用Trizol Reagent提取總RNA，提取方法不成熟時，提取的總RNA質(zhì)量低，逐漸完善Trizol Reagent提取RNA的技術(shù)，最后提取的總RNA呈現(xiàn)28S rRNA，18S rRNA和5.8S rRNA三條清晰完整的條帶，用核酸蛋白測定儀檢測所提RNA的純度，其OD260/280值為1. 945，OD260/230值為2. 134，說明提取的總RNA具有很高的純度，為后續(xù)相關(guān)免疫應(yīng)答基因的研究奠定基礎(chǔ)。

[1]李小兵,劉黎,陸荷花. 和田黑雞種質(zhì)資源保護(hù)與利用探討[J]. 禽業(yè)技術(shù), 2010, 07(13): 120-125.

[2]焦珍珍,吳君來. 和田黑雞種質(zhì)資源保護(hù)現(xiàn)狀與對策[J]. 中國畜禽種業(yè), 2011, 09(4): 119-121.

[3]陸荷花,李小兵,張萬和.新疆和田黑雞的飼養(yǎng)管理與開發(fā)利用.[J]. 當(dāng)代畜牧, 2010, 04(6): 4-6.

[4]Khobondo. J . O, Okeno . T . O, et al.Wasike and A .K . kahi . The fast, present and fufure genetic improv ment of indigen ous chicken of kenga [J]. Animal Gentic Resour ces , 2014,55:125-135.

[5]You Lu, Liu Ci, Yang Zijiang, et al. Prediction of Selenoprotein T Structure and Its Response to Selenium Deficiency in Chicken Immune Organs[J]. Biological Trace Element Research, 2014, 160(2):222-231.

[6]謝昆,蔣成硯,全舒舟,等. 雞外周血淋巴細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)[J]. 中國家禽, 2011, 33 (11): 57-58.

[7]賀艷艷,潘輝,劉書東,等. 新疆多浪羊淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng)[J]. 塔里木大學(xué)學(xué)報, 2010, 22(04): 11-14.

[8]朱德華,等. 快速純化真核細(xì)胞總RNA方法的改良[J]. 河南醫(yī)學(xué)研究, 2001, 15(3): 115-117

[9]盧圣棟. 現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M]. 北京:高等教育出版社. 1993,59.

Isolation and Total RNA Extraction of Lymphocyte from Hetian Black Chicken

Li Wei1Ai Dongxu1Li Lianrui2,3*

(1 College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)(2 College of Animal Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)(3 Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production &Construction Group, Alar, Xinjiang 843300)

The experiment investigated the optimum separation conditions and the total RNA extraction method of lymphocyte, which provide the most effective experimental materials for the immunological study of lymphocytes in Hetian black chicken. Lymphocyte was separated by centrifugation and detected the cell activity. The total RNA was extracted from the peripheral blood lymphocytes by Trizol method. The results showed that the best effect of centrifugal separation was 1:1 ratio of Ca2+, Mg2+-Hank’S dilution of anticoagulant, room temperature, 2000 rpm/min, 35 min. Agarose gel electrophoresis showed three band of 28S, 18S and 5.8S,the OD260 / 280value of Total RNA was 1.996 and the concentration was 283 μg/ml, which indicating that high quality total RNA was extracted, laying a solid foundation for the follow-up studies.

Hetian black chicken; lymphocyte; total RNA

2015-06-10

李瑋(1989-),女,在讀碩士,研究方向為動物基因工程。E-mail：1225064596@qq.com

*為通訊作者E-mail：lilianrui51@163.com

1009-0568(2016)01-0001-04

S826

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.01.001