路丹　丁文惠　彭芬　李軍　趙靜　葉小巾

?

·基礎(chǔ)研究·

尾加壓素Ⅱ誘導(dǎo)巨噬細胞分泌巨噬細胞集落刺激因子

路丹丁文惠彭芬李軍趙靜葉小巾

目的探索尾加壓素Ⅱ(UⅡ)能否促進小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞分泌巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，并探討相關(guān)的信號機制。方法培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞，以Real-time PCR法和ELISA法分別檢測細胞的M-CSF mRNA和蛋白表達水平，用細胞免疫印跡法檢測p38MAPK和ERK的磷酸化水平。結(jié)果UⅡ呈濃度依賴性和時間依賴性促進RAW264.7細胞中M-CSF mRNA和蛋白水平的表達，最大效應(yīng)時間均為刺激12 h，M-CSF mRNA水平是對照組水平的2.73倍，蛋白表達水平顯著高于對照組水平[(50.04±4.28)pg/ml比(20.39±2.75) pg/ml，P<0.01]，是對照組水平的2.45倍；最大效應(yīng)濃度均為10-8mol/L和10-7mol/L，以10-8mol/L UⅡ刺激12 h，M-CSF的mRNA和蛋白表達水平較對照組分別增加了97.3%和80.8%。采用UⅡ受體(UT)阻斷劑Urantide、ERK阻斷劑PD98059和p38MAPK阻斷劑SB203580分別預(yù)處理細胞后，M-CSF蛋白水平較UⅡ組顯著降低，分別為[(45±4.04) pg/ml比(57.47±2.93)pg/ml]、[(42.13±4.28) pg/ml比(57.47±2.93)pg/ml]和[(44±5.34) pg/ml比(57.47±2.93)pg/ml]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。10-8mol/L UⅡ刺激細胞3 min顯著促進ERK和p38MAPK蛋白磷酸化，5 min時ERK磷酸化水平達到峰值，至15 min仍持續(xù)高值，而p38MAPK在15 min時磷酸化達到峰值；30 min時，兩者的磷酸化水平均減弱。結(jié)論UⅡ可通過與受體結(jié)合活化ERK和p38MAPK信號通路促進RAW264.7細胞中M-CSF的表達。

巨噬細胞集落刺激因子；炎癥；尾加壓素Ⅱ

尾加壓素Ⅱ(urotensin Ⅱ, UⅡ)是一種重要的血管活性肽，自1999年發(fā)現(xiàn)UⅡ在人冠狀動脈粥樣硬化斑塊中強表達以來，UⅡ在動脈粥樣硬化中的作用備受關(guān)注[1]。本研究組前期研究顯示，嚴重冠狀動脈疾病患者血漿UⅡ水平升高，與冠心病的嚴重程度密切相關(guān)[2]，載脂蛋白E缺陷鼠(ApoE-/-)第18、28和38周UⅡ受體(UT)表達逐漸增加[3]。另有研究報道UⅡ慢性灌注增加ApoE-/-鼠泡沫細胞和動脈粥樣硬化斑塊形成[4]。體外研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ可促進多種炎癥因子、血管生成因子的分泌，參與了動脈粥樣硬化病理過程的多個環(huán)節(jié)[5-9]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)UⅡ可通過p42/44絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖和抗凋亡，促進單核巨噬細胞分泌單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)[5-6]。也有研究發(fā)現(xiàn)UⅡ可促進HUVECs增殖和分泌白介素8(IL-8)，促進平滑肌細胞增殖和單核細胞趨化[7-9]。

巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)由受損的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及單核巨噬細胞分泌，在調(diào)節(jié)單核巨噬細胞的存活、分化、增殖和趨化上起著十分重要的作用。盡管UⅡ和M-CSF均可調(diào)節(jié)單核巨噬細胞的多種效應(yīng)，但UⅡ能否促進巨噬細胞分泌M-CSF尚不明確。因此，本研究探索UⅡ能否促進小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞分泌M-CSF，并探討相關(guān)信號機制。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞購自協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞中心。DMEM培養(yǎng)基、Gibco胎牛血清(FBS)、TRIzol試劑、高保真cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Select Master Mix均購自美國Life Technologies公司，小鼠M-CSF ELISA試劑盒購自美國Abcam公司，小鼠UⅡ購自美國Phoenix公司，UT阻斷劑Urantide購自美國Peptides公司；p38MAPK通路阻斷劑SB203580、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extra-cellular signal regulated kinase,ERK)通路阻斷劑PD98059均購自美國Selleckchem公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列如下：M-CSF F，5′-ACCGAGAGGCTCCAGGAA CT-3′；M-CSF R，5′-GTTCGGACACAGGCCTTGTT- 3′；β-actin F，5′-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3′；β-actin R， 5′- CACAGCCTGGATGGCTACGT-3′。磷酸化ERK和磷酸化p38 MAPK抗體、總ERK和總p38 MAPK抗體均購自美國CST公司?；瘜W(xué)發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.2細胞培養(yǎng)和實驗設(shè)計

常規(guī)紫外照射消毒超凈臺，在超凈臺內(nèi)配含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)在5%CO2的37℃孵箱。細胞呈圓形，匯合至80%時用培養(yǎng)基輕輕吹打下來，以1∶4～1∶6比例傳代。取對數(shù)期細胞做實驗。

將RAW261.7細胞接種于6孔板中，每孔約3×105個細胞，待細胞鋪滿皿底60%時，改用含1% FBS培養(yǎng)液同步化12 h后，對細胞分別進行如下干預(yù)：(1)分別用10-8mol/L UⅡ刺激0、 2、4、8、12、24和36 h，提取細胞總RNA，收集培養(yǎng)液上清于-80℃冰箱保存，以后做ELISA；(2)用不同濃度的UⅡ(10-10～10-7mol/L)刺激細胞12 h，提取細胞總RNA，收集培養(yǎng)液上清于-80℃冰箱保存，以后做ELISA；(3)用UT阻斷劑Urantide(10-6mol/L)、ERK阻斷劑PD98059(10-6mol/L)和p38 MAPK阻斷劑SB203580(10-6mol/L)預(yù)處理細胞1 h后，再用10-8mol/L UⅡ刺激12 h，離心后提取細胞總RNA，收取上清于-80℃冰箱保存，以后做ELISA。

1.3細胞總RNA提取

Trizol法提取各組細胞的總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA濃度和純度, 在260 nm和280 nm波長下的光密度比值均為1.6～1.8。

1.4逆轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR

按照高保真cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取各組細胞總RNA樣本1 μg，加入逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，隨機引物2 μl，10×RT緩沖液2 μl，25×dNTP混合物0.8 μl,總體積20 μl，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件為25℃，10 min；37℃，120 min，85℃，5 min，溫度降至4℃時取出cDNA進行Real-time PCR。

取cDNA產(chǎn)物1 μl做模板，將上游、下游引物稀釋至2 μmol/L，采用非特異性染料(SYBR GreenⅠ)法進行Real-time PCR。20 μl體系包括cDNA 1 μl、上游引物2 μl(終濃度200 nmol/L)、下游引物2 μl(終濃度200 nmol/L)、dH2O 5 μl和Mix 10 μl。在ABI 7300 Real-time PCR儀上采用2步法進行反應(yīng)。循環(huán)參數(shù)為變性溫度95℃，10 min；退火溫度95℃，15 s；延伸溫度60℃，1 min，共40個循環(huán)，4℃保存。同時增加溶解曲線觀察擴增情況。反應(yīng)結(jié)束后從儀器上讀取CT值，以同一模板中目的基因和管家基因β-actin的相對濃度的比值作為目的基因相對轉(zhuǎn)錄水平，采用2-ΔΔCT法在各實驗組中比較。

1.5ELISA

收集各組細胞培養(yǎng)基上清，以1000 r/min離心10 min，取上清分裝置于1.5 ml EP管中于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.6免疫印跡檢測

將各組細胞棄上清，以PBS沖洗3遍，加入蛋白裂解液提取總蛋白，用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)測定蛋白濃度， 95℃，5 min。配10% SDS-PAGE凝膠，上樣量約20 μg進行電泳，濃縮膠80 V，30 min，分離膠100 V，1 h；200 mA 轉(zhuǎn)膜1.5 h；牛血清蛋白溶液(5%BSA)封閉1 h；一抗(p-ERK、p-p38MAPK均1∶1000)4℃過夜；TBST洗滌3次，二抗(1∶8000)孵育1 h；TBST洗滌3次，發(fā)光。膜再生液洗滌30 min，重新封閉1 h，孵總蛋白(ERK、p38MAPK均1∶1000)過夜；TBST洗滌3次，二抗(1∶8000)孵育1 h；TBST洗滌3次，發(fā)光。Image J分析灰度值，計算磷酸化蛋白/總蛋白。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1用Real-time PCR測定M-CSF的mRNA水平情況

Real-time PCR測定UⅡ(10-8mol/L)不同時間刺激RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn)，UⅡ刺激4 h能引起M-CSF mRNA水平增加(P<0.05)，較基線提高了約64.2%，刺激12 h達到最大值(P<0.01)，約為對照組的2.73倍，刺激36 h仍持續(xù)在較高水平(P<0.01)(圖1 A)；不同濃度的UⅡ(10-9～10-7mol/L)刺激RAW264.7細胞12 h均能顯著促進M-CSF mRNA表達(均P<0.01)，濃度為10-8mol/L和10-7mol/L時達到最大值，10-8mol/L時較對照組約增加了97.3%(P<0.01，圖1 B)。因此，UⅡ呈濃度和時間依賴性地促進RAW264.7細胞中M-CSF mRNA水平的表達。

2.2以ELISA法測定M-CSF蛋白的分泌情況

用ELISA法測定不同時間UⅡ(10-8mol/L)刺激RAW264.7細胞發(fā)現(xiàn)，刺激4 h后M-CSF蛋白分泌量較對照組顯著增加[(29.64±3.55) pg/ml比(20.39±2.75) pg/ml，P<0.05]，增加了45.4%；刺激12 h后，M-CSF蛋白水平達到最大值[(50.04±4.28)pg/ml比(20.39±2.75) pg/ml，P<0.01]，約為對照組的2.45倍；刺激36 h仍持續(xù)在較高水平(P<0.01)(圖2 A)。不同濃度的UⅡ(10-9、10-8、10-7mol/L)刺激12 h后，M-CSF的分泌量較對照組顯著增加[(39.02±2.66)pg/ml比(25.85±2.49)pg/ml、(46.74±2.77) pg/ml比(25.85±2.49)pg/ml、(52.11±2.78) pg/ml比(25.85±2.49)pg/ml]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，濃度為10-8mol/L和10-7mol/L時達到峰值，10-8mol/L時較對照組約增加了80.8%(圖2 B)。因此，UⅡ呈時間和濃度依賴性地促進RAW264.7細胞分泌M-CSF蛋白。

2.3p38MAPK通路和ERK通路參與M-CSF蛋白分泌情況

為了探索p38MAPK通路和ERK通路是否參與了UⅡ誘導(dǎo)的M-CSF釋放，用UT阻斷劑Urantide、ERK阻斷劑PD98059和p38MAPK阻斷劑SB203580分別預(yù)處理細胞1 h，然后用UⅡ(10-8mol/L)刺激12 h, 檢測M-CSF表達水平。結(jié)果顯示，Urantide、PD98059和SB203580預(yù)處理細胞后較UⅡ組M-CSF的mRNA水平分別降低了54.3%、51.2%和49.7%。UⅡ組M-CSF水平較對照組顯著升高[(57.47±2.93) pg/ml比(31.38±4.22) pg/ml，P<0.01，圖3A]。Urantide、PD98059和SB203580預(yù)處理細胞后M-CSF的蛋白水平較UⅡ組顯著降低[(45±4.04) pg/ml比(57.47±2.93) pg/ml、(42.13±4.28) pg/ml比(57.47±2.93) pg/ml、(44±5.34) pg/ml比(57.47±2.93) pg/ml]，分別降低了47.8%、58.8%和51.6%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05，圖3B)。表明UT、ERK通路和p38MAPK通路均參與了UⅡ誘導(dǎo)的M-CSF分泌。

2.4用細胞免疫印跡檢測p38MAPK和ERK的磷酸化情況

以10-8mol/L UⅡ刺激RAW264.7細胞0、3、5、15和30 min，發(fā)現(xiàn)UⅡ刺激3 min，p38MAPK、ERK顯著磷酸化，5 min時ERK磷酸化水平達到峰值，至15 min仍持續(xù)高值，而p38MAPK在15 min時磷酸化達到峰值；30 min時，兩者的磷酸化水平均減弱(圖4)。

圖1　用Real-time PCR測定RAW264.7細胞中M-CSF的mRNA表達　M-CSF，巨噬細胞集落刺激因子；UⅡ，尾加壓素Ⅱ；a，與對照組比較，P<0.05；b，與對照組相比，P<0.01(n=3)

圖2　ELISA法測定RAW264.7細胞中M-CSF的蛋白分泌　M-CSF，巨噬細胞集落刺激因子；UⅡ，尾加壓素Ⅱ；a，與對照組相比，P<0.05;b，與對照組相比，P<0.01(n=3)

圖3　ERK通路和p38MAPK通路參與了UⅡ誘導(dǎo)的M-CSF分泌　UA，尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑Urantide,10 μmol/L； PD，ERK通路阻斷劑PD98059,10 μmol/L；SB，p38MAPK通路阻斷劑SB203580, 10 μmol/L；UⅡ，尾加壓素Ⅱ；M-CSF，巨噬細胞集落刺激因子；ERK，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；p38MAPK,p38絲裂原活化蛋白激酶；a，與對照組相比，P<0.05;b，與對照組相比，P<0.01;c，與UⅡ組相比，P<0.05(n=3)

3　討論

單核巨噬細胞是動脈粥樣硬化病理過程中最重要的炎癥細胞，在動脈粥樣硬化的各個環(huán)節(jié)——從泡沫細胞的形成到斑塊進展、斑塊不穩(wěn)定及斑塊破裂都發(fā)揮了重要作用[10]。抑制單核細胞進入血管壁形成巨噬細胞可能減緩動脈粥樣硬化的進展[11-12]。單核細胞和巨噬細胞還是表達UT最多的細胞[7]，UⅡ在泡沫細胞豐富的區(qū)域強表達，提示UⅡ/UT可能在單核巨噬細胞的效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]。

圖4　UⅡ促進ERK和p38MAPK蛋白磷酸化　UⅡ，尾加壓素Ⅱ；ERK，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；p38MAPK，p38絲裂原活化蛋白激酶；a，與基線組相比，P<0.05;b，與基線組相比，P<0.01(n=3)

M-CSF與冠心病密切相關(guān)。M-CSF在穩(wěn)定型和不穩(wěn)定型心絞痛患者中均升高[13-14]，是心絞痛患者遠期冠心病事件的獨立預(yù)測因子[13]。體外試驗也證實M-CSF是調(diào)節(jié)單核巨噬細胞系存活、生長、分化和趨化的細胞因子[15]，M-CSF還可刺激局部內(nèi)皮細胞和巨噬細胞產(chǎn)生更多的M-CSF[16]。M-CSF刺激巨噬細胞后立即引起細胞極化，細胞骨架重組并遷移到M-CSF所在部位。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UⅡ可呈時間和濃度依賴性地促進M-CSF在RAW264.7細胞中mRNA的表達和蛋白分泌。本研究組前期工作還發(fā)現(xiàn)UⅡ可促進MCP-1的分泌[5]，表明UⅡ是一種致炎和致動脈粥樣硬化因子，可能通過促進單核巨噬細胞分泌M-CSF促進細胞存活，促進局部更多M-CSF生成，通過M-CSF和MCP-1趨化更多的單核巨噬細胞到炎癥部位，從而加重局部的炎癥反應(yīng)，促進和維持動脈粥樣硬化形成。

本研究發(fā)現(xiàn)10-8mol/L UⅡ刺激12 h時M-CSF的表達量達到較高水平。有文獻報道20 nmol/L UⅡ刺激人冠狀動脈內(nèi)皮細胞6 h，組織因子水平顯著增加，刺激12 h還可顯著增加細胞黏附因子1和血管細胞黏附因子1的表達[17]。 30 nmol/L UⅡ刺激HUVECs 24 h，IL-8表達水平較高[8]。本研究組前期工作也發(fā)現(xiàn)10-8mol/L UⅡ刺激大鼠血管外膜成纖維細胞24 h, 血管內(nèi)皮生長因子、白三烯C4蛋白水平達到高峰[18-19]。這些結(jié)果均表明，UⅡ刺激較短時間可促進血管壁細胞合成細胞黏附分子，促進單核巨噬細胞分泌趨化因子，從而促進炎癥細胞黏附到血管壁和促進炎癥細胞趨化到炎癥部位；刺激較長時間則促進炎癥因子的分泌。即UⅡ的效應(yīng)可能與UⅡ刺激的細胞類型、所檢測因子的性質(zhì)和功能有關(guān)。

UⅡ誘導(dǎo)M-CSF在RAW264.7細胞中分泌的機制與UⅡ誘導(dǎo)IL-8在HUVECs、白三烯C4在大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞中分泌的機制相似[8, 20]。UⅡ可通過與受體結(jié)合后活化p38MAPK通路和ERK通路促進HUVECs合成IL-8[8]、促進大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞分泌白三烯C4。M-CSF的生成也可受p38MAPK通路和ERK通路調(diào)控[21]。本研究發(fā)現(xiàn)UⅡ通過與受體結(jié)合，活化p38MAPK通路和ERK通路促進單核巨噬細胞分泌M-CSF，這些通路可能在UⅡ介導(dǎo)的單核巨噬細胞的各種效應(yīng)中發(fā)揮作用。

綜上所述，UⅡ可通過活化UT，激活p38MAPK通路和ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進M-CSF在RAW264.7細胞中mRNA和蛋白水平的表達。本研究提供了新的UⅡ效應(yīng)的視角，UⅡ可能促進巨噬細胞自分泌M-CSF，從而促進動脈粥樣硬化的血管壁炎癥反應(yīng)。阻斷UT可能抑制巨噬細胞分泌M-CSF，一定程度上延緩動脈粥樣硬化進程。

[1] Ames RS, Sarau HM, Chambers JK, et al. Human urotensin-Ⅱ is a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14. Nature, 1999,401(6750):282-286.

[2] 張麗芳, 陳莉, 丁文惠, 等. 血漿尾加壓素Ⅱ濃度與冠狀動脈病變程度的關(guān)系.中日友好醫(yī)院學(xué)報, 2008，22(1)：3-6.

[3] Wang ZJ, Shi LB, Xiong ZW, et al. Alteration of vascular urotensin Ⅱ receptor in mice with apolipoprotein E gene knockout. Peptides, 2006,27(4):858-863.

[4] Shiraishi Y, Watanabe T, Suguro T, et al. Chronic urotensin Ⅱ infusion enhances macrophage foam cell formation and atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice. J Hypertens, 2008,26(10):1955-1965.

[5] 邸北冰, 丁文惠, 趙靜, 等. 尾加壓素Ⅱ誘導(dǎo)巨噬細胞表達單核細胞趨化蛋白1上調(diào)及機制研究. 中華老年心腦血管病雜志, 2011，13(10)：925-928.

[6] Shi L, Ding W, Li D, et al. Proliferation and anti-apoptotic effects of human urotensin Ⅱ on human endothelial cells. Atherosclerosis, 2006,188(2):260-264.

[7] Segain JP, Rolli-Derkinderen M, Gervois N, et al. Urotensin Ⅱ is a new chemotactic factor for UT receptor-expressing monocytes. J Immunol, 2007,179(2):901-909.

[8] Lee CY, Tsai YT, Loh SH, et al. Urotensin Ⅱ induces interleukin 8 expression in human umbilical vein endothelial cells. PLoS One, 2014,9(2):e90278.

[9] Rodríguez-Moyano M, Díaz I, Dionisio N, et al. Urotensin-Ⅱ promotes vascular smooth muscle cell proliferation through store-operated calcium entry and EGFR transactivation. Cardiovasc Res, 2013,100(2):297-306.

[10] Laguna JC, Alegret M. Regulation of gene expression in atherosclerosis: insights from microarray studies in monocytes/macrophages. Pharmacogenomics, 2012,13(4):477-495.

[11] Moulton KS, Vakili K, Zurakowski D, et al. Inhibition of plaque neovascularization reduces macrophage accumulation and progression of advanced atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,100(8):4736-4741.

[12] Jaipersad AS, Lip GY, Silverman S, et al. The role of monocytes in angiogenesis and atherosclerosis. J Am Coll Cardiol, 2014,63(1):1-11.

[13] Ikonomidis I, Lekakis J, Revela I, et al. Increased circulating C-reactive protein and macrophage-colony stimulating factor are complementary predictors of long-term outcome in patients with chronic coronary artery disease. Eur Heart J, 2005,26(16):1618-1624.

[14] Hojo Y, Ikeda U, Takahashi M, et al. Increased levels of monocyte-related cytokines in patients with unstable angina. Atherosclerosis, 2002,161(2):403-408.

[15] Thorpe R, Wadhwa M, Bird CR, et al. Detection and measurement of cytokines. Blood Rev, 1992,6(3):133-48.

[16] Roth P, Stanley ER. The biology of CSF-1 and its receptor. Curr Top Microbiol Immunol, 1992,181:141-167.

[17] Cirillo P, De Rosa S, Pacileo M, et al. Human urotensin Ⅱ induces tissue factor and cellular adhesion molecules expression in human coronary endothelial cells: an emerging role for urotensin Ⅱ in cardiovascular disease. J Thromb Haemost, 2008,6(5):726-736.

[18] Song N, Ding W, Chu S, et al. Urotensin Ⅱ stimulates vascular endothelial growth factor secretion from adventitial fibroblasts in synergy with angiotensin Ⅱ. Circ J, 2012,76(5):1267-1273.

[19] Dong X, Ye X, Song N, et al. Urotensin Ⅱ promotes the production of LTC4 in rat aortic adventitial fibroblasts through NF-kappaB-5-LO pathway by p38 MAPK and ERK activations. Heart Vessels, 2013,28(4):514-523.

[20] Djordjevic T, BelAiba RS, Bonello S, et al. Human urotensin Ⅱ is a novel activator of NADPH oxidase in human pulmonary artery smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005,25(3):519-525.

[21] Guan SM, Zhang M, He JJ, et al. Mitogen-activated protein kinases and phosphatidylinositol 3-kinase are involved in Prevotella intermedia-induced proinflammatory cytokines expression in human periodontal ligament cells. Biochem Biophys Res Commun, 2009,386(3):471-476.

Urotensin Ⅱ induces macrophages to produce macrophage colony-stimulating factor

LU Dan, DING Wen-hui, PENG Fen, LI Jun, ZHAO Jing, YE Xiao-jin.

Department of Cardiology, Peking University, First Hospital, Beijing 100034, China Corresponding author: DING Wen-hui, Email：dwh_rd@126.com

ObjectiveTo investigate the role of urotensin Ⅱ in M-CSF secretion from RAW264.7 macrophages and the relevant signal mechanisms. MethodsThe RAW264.7 cell line was cultured. The mRNA expression and protein level of M-CSF were determined by real time polymerase chain reaction and Enzyme-linked immunosorbent assay, respectively. Western blot was applied to assay the phosphorylation status of ERK and p38MAPK. ResultsUⅡ increased the expression of M-CSF mRNA and protein in a concentration- and time-dependent manner with the peak at 12 h of treatment (P<0.01), when the gene and protein level of M-CSF was about 1.73 and 1.45 times more than the baseline level, respectively. The maximal effect was reached at 10-8mol/L and 10-7mol/L (bothP<0.01). Compared with the control group, the mRNA and protein expression of M-CSF increased by 97.3% and 80.8% after 12 h of UⅡ stimulation. The UⅡ effects were significantly inhibited by its receptor (UT) antagonist urantide, the SB203580 p38MAPK inhibitor and the PD98059 ERK inhibitor. 10-8mol/L UⅡ also enhanced ERK and p38MAPK phosphorylation in RAW264.7 macrophages. ConclusionsUrotensin Ⅱ promotes M-CSF release in RAW264.7 macrophages via p38MAPK and ERK signaling pathways.

Macrophage colony-stimulating factor；Inflammation;Urotension Ⅱ

10.3969/j.issn.1004-8812.2016.08.007

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20120001120010)

100034北京，北京大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科

丁文惠，Email：dwh_rd@126.com

R363

2016-04-29)