符　婷，石建黨，匡　霞，王素莉1,

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2型糖尿病患者SLC22A1，SLC22A2基因多態(tài)性與二甲雙胍胃腸道不良反應的關系

符婷1，2，石建黨3，匡霞2，王素莉1,2

目的探討2型糖尿病(T2DM)患者SLC22A1 1222A>G位點及SLC22A2 808G>T位點基因多態(tài)性與二甲雙胍胃腸道不良反應之間的關系。方法隨機選取130例就診于我院內分泌科初次接受二甲雙胍治療的T2DM患者，從患者外周血白細胞中提取DNA，應用等位基因特異引物PCR反應(Allele-specific PCR,AS-PCR)及凝膠成像技術進行基因分型，分析1222A>G及808G>T位點多態(tài)性與二甲雙胍胃腸道不良反應的關系。結果SLC22A1 1222A>G位點存在AA、AG、GG三種基因型，突變頻率為64.62%，A等位基因與二甲雙胍胃腸道不良反應的發(fā)生相關(P<0.05)；SLC22A2 808G>T位點存在GG、GT、TT三種基因型，突變頻率為11.15%，該位點不同基因型患者發(fā)生二甲雙胍胃腸道不良反應的概率不存在統(tǒng)計學差異(P=0.559)；二甲雙胍胃腸道反應陽性組患者年齡大于胃腸道反應陰性患者(P=0.037)；二甲雙胍胃腸道反應陽性組患者收縮壓高于胃腸道反應陰性患者(P=0.017)。結論T2DM患者SLC22A1 1222A>G基因多態(tài)性與二甲雙胍胃腸道不良反應的發(fā)生相關，SLC22A2808G>T基因多態(tài)性與二甲雙胍胃腸道不良反應的發(fā)生無關；老齡及高收縮壓可能是造成二甲雙胍胃腸道不良反應的危險因素。

二甲雙胍；SLC22A1；SLC22A2；基因多態(tài)性；胃腸道不良反應

國內外指南均推薦二甲雙胍作為T2DM患者的一線用藥，因其不但能有效降低空腹及餐后血糖，還有保護心血管[1]、調節(jié)血脂[2-4]、改善肝臟纖維化[5]、治療多囊卵巢綜合征[6]等降糖外作用，因此也被廣泛用于糖尿病以外的疾病。但二甲雙胍可引起惡心、腹瀉、腹脹、嘔吐、消化不良、腹痛等較為明顯的胃腸道不良反應[7]，5%的患者因無法耐受而終止使用。二甲雙胍在體內發(fā)揮臨床藥理學作用主要通過有機陽離子轉運體OCT1、OCT2介導[8]。近期研究發(fā)現，有機陽離子轉運體基因多態(tài)性不僅可對二甲雙胍的藥動學及藥效學造成影響[9, 10]，還與二甲雙胍胃腸道不良反應相關[11, 12]，但結論并不統(tǒng)一。依據基因位點多態(tài)性個性化用藥可提高藥物有效率、降低不良反應的發(fā)生、降低用藥成本，也是轉化醫(yī)學及精準醫(yī)療的發(fā)展方向。在Latvian人群中SLC22A1 1222A>G多態(tài)性改變[11]和二甲雙胍引起的胃腸道不良反應存在相關性。在OCT2的所有突變位點中，SLC22A2 808G>T變率最高，且所有種族均有發(fā)現。本研究通過對130例T2DM患者SLC22A1 1222A>G和SLC22A2 808G>T進行位點測定，分析其基因多態(tài)性與二甲雙胍胃腸道不良反應之間的關系。

1　對象與方法

1.1對象隨機選取2014-11～2015-06間就診于我院的T2DM患者130例，男64例，女66例。所有患者在入組時均初次服用二甲雙胍(格華止，上海施貴寶公司),口服劑量均為500～2000 mg/d。

1.2入選標準就診前已確診為T2DM或初發(fā)糖尿病且符合1999年WHO診斷標準，年齡30～80歲。

1.3排除標準(1)未服用二甲雙胍的患者；(2)1型糖尿病、特殊類型糖尿?。?3)并發(fā)糖尿病酮癥等急性并發(fā)癥；(4)肝腎功能不全；(5)妊娠或哺乳期婦女;(6)合并急慢性胃腸道疾病者；(7)腫瘤患者；(8)合并其他疾病需同時服用腎上腺素、糖皮質激素等影響糖代謝藥物者；(9)服用其他可引起胃腸道反應如阿卡波糖等藥物者；(10)服用維拉帕米、奧美拉唑、螺內酯等OCT1抑制劑的患者；(11)服用可卡因、丙米嗪、普魯卡因酰胺、奎尼丁等OCT2抑制藥的患者。

1.4觀察指標記錄患者年齡、性別、糖尿病病程等；測量身高、體重，計算體重指數(BMI)；血壓，包括收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)；測定糖化血紅蛋(HbA1C)、血尿酸(BUA)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血總膽固醇(TC) 、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.5基因型測定空腹采集患者外周血1 ml，抗凝處理；使用血液基因組DNA提取試劑盒(NEWBIO INDUSTRY公司提供)提取基因組DNA，使用凝膠電泳成像技術確定所提取DNA 純度合格，純度不合格者再次進行DNA提??；根據NCBI網站中Primer工具設計1222A>G及808G>T位點PCR引物，野生型位點及突變型位點分別設計引物，SLC22A1 1222A>G上游引物序列為5′-TGCTCTATCAGGGGCTCATCC-3′，下游野生引物序列為5′-CCCCGCCAACAAATTTGACAT-3′，下游突變引物序列為5′-CCCCGCCAACAAATTTGACAC-3′，PCR擴增片段長度為167 bp。SLC22A2 808G>T上游引物序列為5′-AGGCCTTTCATCCCATCTAC-3′，下游野生引物序列為5′-AAGAAGAAGTTGGGCAGAGC-3′，下游突變引物序列為5′-AAGAAGAAGTTGGGCAGAGA-3′，PCR擴增片段長度為382 bp。委托江蘇金唯智公司合成引物序列。PCR反應體系均為25 μl，包括：模板1 μl，上游引物0.5 μl，下游野生引物0.5 μl或下游突變引物0.5 μl，PCR Master Mix12.5 μl，ddH2O10.5 μl(PCR Master Mix包括dNTP、loading buffer、Taq DNA聚合酶、Mg2+、穩(wěn)定劑、染料等,由NEWBIO INDUSTRY公司提供)。SLC22A1 1222A>G位點的PCR反應條件為：95℃預變性3 min，然后95℃變性15 s、64℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存30 s。SLC22A2 808G>T位點的PCR反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性15 s、60℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃保存30 s。PCR產物加至點樣槽中進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察DNA條帶，并鑒定位點基因型。

1.6胃腸道不良反應的界定在服用二甲雙胍治療過程中如出現惡心、腹瀉、腹脹、嘔吐、胃脹、消化不良、腹痛等其中一項及以上癥狀者為陽性組，無不適者為陰性組。得到陽性組40例和陰性組90例。

2　結　　果

2.1一般資料臨床病例資料分為陽性組和陰性組。兩組性別、病程、BMI、DBP無統(tǒng)計學差異，HbA1C、TC、LDL-C、Scr、BUN、BNA無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；兩組人群年齡存在統(tǒng)計學差異，陽性組患者年齡大于陰性組患者(P<0.05)；兩組收縮壓存在統(tǒng)計學差異，陽性組患者收縮壓高于陰性組患者(P<0.05，表1)。

2.2兩組1222A>G基因型分布與等位基因頻率比較1222A>G位點可見AA、AG、GG三種測序結果，基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=1.58，P>0.05)，說明該樣本能代表群體的基因分布。胃腸道反應陽性組及陰性組基因型分布存在統(tǒng)計學差異，兩組間等位基因A、G頻率存在統(tǒng)計學差異，胃腸道反應陽性組A等位基因頻率高于胃腸道反應陰性組(P<0.05，表2)。

表1　胃腸道反應兩組一般資料及生化指標比較

表2　胃腸道反應兩組1222A>G、808G

2.3兩組808G>T基因型分布與等位基因頻率比較808G>T位點可見GG、GT、TT三種測序結果，基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.298，P>0.05)，說明該樣本能代表群體的基因分布。由于TT基因型人數較少，故將GG型與GT+TT型進行比較，胃腸道反應陽性組及陰性組基因型分布不存在統(tǒng)計學差異(P=0.559)，兩組間等位基因G、T頻率不存在統(tǒng)計學差異(P=0.754，表3)。

3　討　　論

20%～30%使用二甲雙胍的糖尿病患者會出現胃腸道不良反應[13]，二甲雙胍造成胃腸道不良反應的具體機制并不明確，可能與藥物在消化道黏膜聚集引起刺激有關。OCT1廣泛表達于人體腸黏膜上皮細胞、肝細胞及腎臟基底膜細胞中,在二甲雙胍胃腸道吸收、肝臟攝取、腎臟排泄中起著重要作用。OCT2主要位于人體腎臟基底外側膜，二甲雙胍從體內清除80%依靠OCT2的作用[8]。OCT1及OCT2基因多態(tài)性改變是導致二甲雙胍藥動學及藥效學個體差異的重要因素[14, 15]。

SLC22A1 1222A→G改變可使408位氨基酸發(fā)生Met→Val(M408V)的轉變，SLC22A2 808G→T改變可使270位氨基酸發(fā)生Ala→Ser(A270S)的轉變。轉運體編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性導致的同義突變及非同義突變或可影響轉運蛋白的功能。本研究中SLC22A1 1222A>G中A等位基因頻率為35.38%，G等位基因頻率為64.62%，與Latvian人群存在種族差異，且A等位基因與二甲雙胍胃腸道不良反應的發(fā)生存在相關性。SLC22A2 808G>T位點在研究人群中存在GG、GT、TT三種基因型，突變率為11.15%，與以往研究報道的中國人群12.9%[16]、香港人群13.3%[17]、韓國人群11%[18]基本相近，該位點基因多態(tài)性改變與二甲雙胍胃腸道不良反應不存在相關性，本實驗研究結果與Tarasova等[11]的結論一致。Tarasova的研究表明M408V、delGTAAGTTG基因多態(tài)性改變與二甲雙胍胃腸道不良反應存在相關性，A270S、G465R、R61C、M420del多態(tài)性與二甲雙胍胃腸道不良反應的發(fā)生無關。

有學者認為，二甲雙胍胃腸道不良反應的發(fā)生與基因多態(tài)性造成OCT1轉運體功能下降、二甲雙胍在胃腸道藥物濃度增加有關[12]。該研究通過對服用二甲雙胍的T2DM患者進行SLC22A1C88R、R61C、M420del、G401S、G465R五個位點(其中R61C、M420del、 G401S、G465R體外實驗證實能減弱OCT1對二甲雙胍的轉運能力)檢測，發(fā)現存在2個及2個以上突變位點的患者比存在一個或不存在突變位點的患者發(fā)生不良反應的概率高2倍。但目前未發(fā)現M408V、delGTAAGTTG兩個位點多態(tài)性改變會減弱OCT1轉運體對二甲雙胍的轉運能力，M408V基因多態(tài)性改變也并未對二甲雙胍的腎臟清除率造成影響[19]；而A270S突變卻可導致OCT2對二甲雙胍的攝取能力降低、血藥濃度增高、腎臟清除率降低[18, 20]。基因多態(tài)性改變導致轉運體對二甲雙胍的轉運能力下降或許只是原因之一。TanjaDujic研究還表明，老齡及女性均為胃腸道不良反應發(fā)生的危險因素，而本研究發(fā)現老齡是導致胃腸道不良反應的危險因素，這可能與老齡患者藥物代謝減慢，對二甲雙胍的作用更敏感有關。本研究首次發(fā)現，收縮壓高是導致胃腸道不良反應的危險因素，具體機制有待后期研究進一步明確。

除OCT1、OCT2外，OCT3、MATE1、MATE2均參與二甲雙胍在體內的轉運過程。二甲雙胍經腎小管分泌到尿液的過程需MATE1及MATE2介導，MATE2還參與二甲雙胍由腸細胞轉運至血液循環(huán)過程[21]。聯(lián)合多個多態(tài)性位點共同分析其與二甲雙胍胃腸道不良反應的關系或許會更有意義。

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(2015-11-11收稿2016-03-01修回)

(責任編輯岳建華)

Association of genetic polymorphisms in SLC22A1 and SLC22A2 with intolerance to metformin in type 2 diabetes

FU Ting1,2，SHI Jiandang3，KUANG Xia2，and WANG Suli1,2.

1.Department of Internal Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China.2.Department of Endocrinology,The Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People’s Armed Police Force,Tianjin 300162,China.3.College of Life Sciences,Nankai University, Tianjin 300017, China

ObjectiveTo study the relationship between gene polymorphisms of 1222A>G in SLC22A1 and 808G>T in SLC22A2 with the gastrointestinal side-effects in metformin-treated type 2 diabetes patients.MethodsOne hundred and thirty type 2 diabetes patients treated with metformin at the first time were recruited.Genomic DNA samples were extracted from the patients’ leukocytes in the peripheral blood.The genotypes were determined by the allele-specific polymerase chain reaction(AS-PCR)and gel electrophoresismethod.ResultsThree genotypes of AA, AG, GG were found in SLC22A11222A>G site and the mutation frequency was 64.62%.An allele of 1222A>G was associated with the incidence of gastrointestinal side-effects of metformin(P<0.05).Three genotypes of GG, GT, TT were found in SLC22A2 808G>T site and the mutation frequency was 11.15%.The incidence of gastrointestinal side effects in metformin-treated type 2 diabetes patients with different genotypes had no significant differences(P=0.559).The patients in metformin intolerance group were older than the patients in metformin tolerance group. The patients in metformin intolerance group had higher systolic blood pressure than the patients in metformin tolerance group.ConclusionsSLC22A11222A>G gene polymorphis was associated with the incidence of gastrointestinal side effects in metformin-treated type 2 diabetes patients, however SLC22A2 808G>T is not.Older age and high systolic blood pressure may be the risk factors for metformin intolerance.

metformin；SLC22A1；SLC22A2；gene polymorphisms；gastrointestinal side-effects

符婷，碩士研究生，醫(yī)師。

1.050000石家莊，河北醫(yī)科大學內科教研室；2.300162天津，武警后勤學院附屬醫(yī)院內分泌科；3.300017天津，南開大學生命科學學院

王素莉，E-mail：wangslwsl@sina.com

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