趙嘉惠　汪慧君　馮　程　尹菁華　林志淼　楊　勇

·論著·

痣樣基底細胞癌綜合征一例PTCH1基因突變研究

趙嘉惠汪慧君馮程尹菁華林志淼楊勇

目的： 檢測一例痣樣基底細胞癌綜合征患者的PTCH1基因突變。方法： 收集患者臨床資料，提取患者及其3位相關(guān)親屬（患者的父母及妹妹）外周血DNA，采用PCR擴增PTCH1基因編碼區(qū)的全部外顯子及其側(cè)翼序列。同時以200名無關(guān)健康者外周血基因組DNA作對照。結(jié)果： 患者的PTCH1基因發(fā)生c.590G＞A雜合突變，導致氨基酸發(fā)生p.W197X改變?；颊叩母改浮⒚妹眉?00名健康對照未見該基因突變位點。結(jié)論： PTCH1基因p.W197X突變很可能是本例患者Gorlin綜合征的病因。

痣樣基底細胞癌綜合征； PTCH1； 突變

痣樣基底細胞癌綜合征（nevoid basal cell carcinoma syndrome，NBCCS）又稱Gorlin綜合征，是一種罕見的常染色體顯性遺傳?。?］。NBCCS的發(fā)病率大約為1/57000，在兒童期及成人期均可發(fā)病。該疾病具有幾乎完全外顯率，主要臨床表現(xiàn)為先天性發(fā)育異常和對某些腫瘤高度易感育異常，主要包括:過度生長、神經(jīng)管閉合不全、骨的異常如分叉肋和多指畸形、顱內(nèi)鈣化等；相關(guān)腫瘤有基底細胞癌、牙源性角化囊腫成神經(jīng)管細胞瘤、橫紋肌肉瘤、腦膜瘤、卵巢癌、乳腺癌等，相關(guān)癥狀可多達100余種［2］。NBCCS的主要致病基因為編碼Patched蛋白的PTCH1和PTCH2基因［3］。我們見到1例NBCCS患者，并通過Sanger測序檢測PTCH1基因突變情況。

1　材料與方法

1.1材料 患者，女，31歲。以“雙側(cè)掌跖出現(xiàn)點狀坑凹16年”就診，無自覺癥狀，隨年齡增長逐漸增多。該患者于22年前發(fā)現(xiàn)右上頜骨角化囊腫在當?shù)蒯t(yī)院行上頜骨囊腫刮除術(shù)。多年來間斷反復出現(xiàn)上、下頜骨囊腫，多次行手術(shù)治療。父母非近親結(jié)婚，否認家族類似疾病史。體格檢查:雙側(cè)掌跖可見針尖大小坑凹，無鱗屑或角化（圖1a）。面型雙側(cè)不對稱，左側(cè)下頜骨升支可捫及明顯膨隆感。右上肢正側(cè)位片提示:右側(cè)肱骨上段多發(fā)類圓型低密度區(qū)。上下頜骨CT掃描顯示:上頜骨右側(cè)磨牙區(qū)見低密度囊性病變，略成膨脹性生長。局部骨壁變薄，局部骨壁缺損且和右上骨壁相同，病灶內(nèi)見牙齒。右上頜骨及左蝶骨竇見高密度影。下頜骨見正中和偏左側(cè)見多個局限性骨質(zhì)破壞，局部骨壁呈蟲蝕樣改變，局部呈膨脹性生長，其內(nèi)骨質(zhì)疏松（圖1b）?？谇唤M織病理示:左、右上頜骨角化性囊腫。顱腦CT:腦鐮處有鈣化灶。下腹部B超提示子宮肌瘤，直徑5.2 cm×4.9 cm左附件區(qū)囊腫，直徑3.5 cm×2.9 cm。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 本研究經(jīng)北京大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，并向患者及其親屬充分說明，簽署書面知情同意書。抽取患者及其3位家庭成員（患者的父母及妹妹）和200名該家系以外正常人外周血3 mL，2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，并采用天根公司血液基因組DNA提取試劑盒（DP319）提取外周血DNA。

1.2.2PCR引物設(shè)計 根據(jù)PTCH1基因序列（來源于ensemble網(wǎng)站，網(wǎng)址:http://asia.ensembl.org/index.html），利用NCBI Primer-BLAST在線版（網(wǎng)址: http://frodo.wimit.edu/primer3）設(shè)計23對特異性引物擴增患者PTCH1基因編碼區(qū)23個外顯子及其側(cè)翼序列，引物由天一輝遠生物科技有限公司合成（表1）。

圖1　痣樣基底細胞癌綜合征患者掌側(cè)皮損圖及上下頜骨CT掃描圖（圖1a箭頭指示皮膚點狀凹陷，圖1b箭頭指示左下頜骨囊腫）

表1　PTCH1 1～23號外顯子引物PCR擴增引物序列

1.2.3PCR擴增PTCH1目的基因反應(yīng)體系及條件PCR反應(yīng)體系25 μL，含基因組DNA 50 ng，dNTPs 0.4 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，上下游引物各為10 μmol/L，Tap DNA聚合酶2.5 U。反應(yīng)條件:95℃預變性5 min后進行10個循環(huán):94℃變性30 s，63℃退火30 s（每個循環(huán)后退火溫度減少0.5℃），72℃延伸45 s，接著進行25個循環(huán):94℃變性30 s，59℃退火45 s， 72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸9 min。DNA擴增在Eppendorf Masercyler Gradient PCR擴增儀上進行。1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產(chǎn)物。所有PCR產(chǎn)物純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司測序部測序。

2　結(jié)果

以患者的基因組DNA為模板，所有23對引物（表1）在各自的條件下分別擴增出各自產(chǎn)物，包括所有外顯子的編碼序列以及兩端至少60 bp的側(cè)翼序列，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后確認片段大小。所有產(chǎn)物純化后測序結(jié)果與 Ensembl網(wǎng)站（http://www.ensembl. org）所公布的序列進行對照發(fā)現(xiàn)，患者的PTCH1基因4號外顯子第590個核苷酸（從cDNA編碼起始位點ATG算起）發(fā)生G→A雜合突變（c.590G＞A），導致編碼氨基酸發(fā)生p.W197X改變，同時對父母的4號外顯子進行驗證，未發(fā)現(xiàn)該突變位點（圖2a、b、c）。突變結(jié)果由反向測序得到驗證，200名無關(guān)健康對照者DNA測序未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)突變。

圖2　a、b、c痣樣基底細胞癌綜合征患者及父母PTCH1基因測序圖（箭頭指示基因突變位點）

3　討論

NBCCS是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，呈高外顯率及差異表現(xiàn)度，其主要的發(fā)病機制為PTCH1基因突變后，導致其編碼的Patched蛋白功能失活，從而引起其下游的Hedgehog信號通路的過度激活［4-6］。在Hedgehog信號轉(zhuǎn)導系中，Patched蛋白為Hedgehog蛋白的受體［7］。正常情況下，PTCH1與Smo以無活性復合體形式存在。當PTCH1基因突變導致功能失活時，Smo可能始終處于激活狀態(tài)，導致Hedgehog信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)功能紊亂，下游靶基因被持續(xù)激活，從而參與腫瘤的發(fā)生［8-9］。

NBCCS患者在皮膚系統(tǒng)的主要臨床表現(xiàn)是多發(fā)痣樣基底細胞癌（50%～65%），及掌跖出現(xiàn)大量點狀小凹（50%～87%）［10］。我們見到該例患者的掌跖部有點狀凹陷NBCCS的特征性皮損。結(jié)合其他系統(tǒng)臨床表現(xiàn)推測該病人可能為NBCCS患者，最終基因檢測也證實了患者為PTCH1基因突變所致的NBCCS。部分患者出生時或兒童早期即可出現(xiàn)多發(fā)基底細胞癌（BCC），數(shù)目可多達1000個［11］，絕大多數(shù)患者腫瘤的侵襲性行為出現(xiàn)在青春期后這提示NBCCS的皮膚表現(xiàn)具有多樣性。推測除了 PTCH1基因突變，BCC的發(fā)生可能還與其他腫瘤基因或Hedgehog信號通路調(diào)節(jié)基因的多態(tài)性，以及后天因素相關(guān)，如與長期日光及長期X線接觸的部位可促使BCC的發(fā)生，長期攝入無機砷或者含砷較高的飲水、食物等可能發(fā)生此種腫瘤，在燒傷或其它瘢痕處也可能出現(xiàn)BCC［12］。本例患者經(jīng)仔細皮膚科體檢及皮膚鏡檢查未發(fā)現(xiàn)基底細胞癌皮損，但需要密切定期隨訪以監(jiān)測基底細胞癌的發(fā)生，以及告知遠離基底細胞癌的可疑誘發(fā)因素，如過度日曬等。

本研究采用分子生物學方法對該患者進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)該患者的PTCH1突變第197位氨基酸發(fā)生無義突變，該結(jié)果證實了該患者確患有NBCCS［3］。由于此類病人皮膚系統(tǒng)臨床表現(xiàn)尚不顯露可能出現(xiàn)誤診、漏診，因此需提示醫(yī)生注意進行鑒別診斷，掌跖部位的坑凹強烈提示NBCCS。部分患者可合并疣狀表皮痣，若在體表發(fā)現(xiàn)，應(yīng)及時去除防止惡變。而對于已經(jīng)出現(xiàn)BCC的病人，可采用手術(shù)切除、電干燥、放療、激光、冷凍、Mohs等多種方法進行治療［13］。

迄今為止，PTCH1基因?qū)е翹BCCS共報道過113種突變，其中81%為錯義或無義突變［14，15］。該病人的PTCH1基因存在p.W197X突變，未在The Human Gene Mutation Database（http://www.hgmd.cf.ac. uk/ac/all.php）基因庫中出現(xiàn)，提示本例出現(xiàn)新發(fā)突變。該突變?yōu)闊o義突變，無義突變很可能導致編碼蛋白質(zhì)的mRNA出現(xiàn)大量降解（nonsense-mediated mRNA decay），從而致使該突變等位基因編碼的蛋白明顯降低。該突變由于出現(xiàn)提前終止的密碼子從而導致截短蛋白，而截短蛋白通常被認為不具有野生型蛋白所具有的功能，但轉(zhuǎn)錄提早終止位置與NBCCS臨床表現(xiàn)無明顯關(guān)系［16］。我們通過基因診斷方法為該患者確診疾病類型，并通過產(chǎn)前診斷避免該疾病在該患者后代中再次出現(xiàn)，對于指導臨床診斷具有重要價值。由于本例患者未出現(xiàn)明顯基底細胞癌樣腫物，還需密切隨訪觀察。

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PTCH1 gene mutation and nevoid basal cell carcinoma syndrome:a case report

ZHAO Jiahui，WANG Huijun，F(xiàn)ENG Cheng，YIN Jinghua，LIN Zhimiao，YANG Yong.
Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China Corresponding author:LIN Zhimiao，E-mail:zhimiaolin@bjmu.edu.cn

Objective:To detect the PTCH1 gene mutation in a patient with nevoid basal cell carcinoma syndrome.Methods:Peripheral blood samples were collected from the patient，her family members，and 200 unrelated healthy controls.DNA was extracted from the blood samples，and subjected to PCR for the amplification of 23 encoding exons and their franking sequences of the PTCH1 gene，followed by DNA sequencing. Results:There was a heterozygous nonsense mutation of c.590G＞A in PTCH1 gene of the patient，resulting in the change of amino acid of p.W197X.This mutation was not detected in any of the family members and the 200 unrelated healthy controls.Conclusion:Heterozygous mutation p.W197X may be the underlying cause of the clinical phenotype of nevoid basal cell carcinoma syndrome in this patient.

nevoid basal cell carcinoma syndrome；PTCH1；mutation

北京科技新星計劃B類（編號:Z151100000315044）

北京大學第一醫(yī)院皮膚科，北京，100034

林志淼，E-mail:zhimiaolin@bjmu.edu.cn