張書芹　許雷　陳盛虎　徐小云　黃瑩婕　姚燕妮　黃友誼

摘要：以龍井43號[Camellia sinensis （L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]鮮葉為材料，經(jīng)分離純化獲得多酚氧化酶-同工酶（PPO II），對其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，PPO II最適反應(yīng)pH為6.0；抑制劑抗壞血酸、亞硫酸鈉和L-半胱氨酸對PPO II的抑制作用隨抑制劑濃度的增加而增強；Cu2+濃度在0.25×10-7 mol/L時，PPO II活性最高；PPO II的Km為13.05 mmol/L，vmax為0.019 OD460/min。

關(guān)鍵詞：龍井43號[Camellia sinensis （L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]；多酚氧化酶；同工酶；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1487-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.031

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1）是茶樹生理學(xué)與茶葉產(chǎn)品加工工藝學(xué)中極為重要的生物酶之一，因此一直是人們的研究熱點[1-3]。當(dāng)前對茶樹PPO的研究已進(jìn)入分子水平[4-8]，國外已有對茶樹PPO同工酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究的報道[9-14]。然而，國內(nèi)對茶樹PPO性質(zhì)的研究一直停留在粗酶的水平[15，16]，除對同工酶譜變化有研究外[17-19]，還未見任何分離純化出同工酶及對同工酶性質(zhì)進(jìn)行研究的報道[20]。為此試驗以適制綠茶的龍井43號茶樹[Camellia sinensis（L.） O. Ktze. cv. Longjing 43]為材料，分離純化出一個PPO同工酶，并對其部分酶性質(zhì)進(jìn)行了探討，以期推動對茶樹PPO的研究與利用[1，21]。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹鮮葉采摘于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)專業(yè)教學(xué)基地中龍井43號茶樹，鮮葉規(guī)格為1芽2葉，采摘時間為春季，采下后迅速于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存，備用。試驗所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 PPO同工酶分離 取龍井43號1芽2葉20 g，用0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液4 ℃浸提12 h，然后4 ℃、9 000 r/min離心30 min，取上清液，濾紙過濾后即為粗酶液。將粗酶液用30 %～80 %硫酸銨沉淀，9 000 r/min離心30 min，棄上清液；用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，3 500 r/min離心30 min，脫鹽3～4次；以上操作均在4 ℃條件下完成。將離子交換劑材料DEAE-Sepharose CL-6B用0.02 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液（4倍體積）進(jìn)行預(yù)平衡，將樣品加入預(yù)平衡柱。加樣完成后，使之與柱材料結(jié)合20 min，然后分別用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L 的NaCl 0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液作為洗脫液，每個濃度梯度洗脫液為3～4倍柱體積，流速60 mL/h。收集峰值洗脫液于超濾離心管中，4 ℃、3 500 r/min離心，脫鹽，濃縮至500 μL左右。各峰值洗脫液分別加入預(yù)平衡（用含有0.1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行預(yù)平衡）Sephadex G-150凝膠柱中，用相同的磷酸鹽緩沖液洗脫，收集各峰值處洗脫液于超濾離心管中，4 ℃、3 500 r/min離心，脫鹽、濃縮至約250 μL左右，4 ℃保存，備用。

1.2.2 抑制劑對PPO同工酶活性的影響 取10 μL酶液，以鄰苯二酚為底物，分別加入終濃度為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mmol/L的抑制劑反應(yīng)混合液75 μL，按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀460 nm處測其殘留酶活性，結(jié)果以殘留酶活性與未加抑制劑的酶活性相比的百分?jǐn)?shù)表示。抑制劑分別為亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸。

1.2.3 pH對PPO同工酶活性的影響 配制pH分別為5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，分別取上述緩沖液4 mL和鄰苯二酚1 mL配制反應(yīng)混合液，在10 μL酶液中加入75 μL的反應(yīng)混合液，于37 ℃條件下反應(yīng)30 min，然后加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀460 nm處測其活性。

1.2.4 底物濃度對PPO同工酶活性的影響 以不同濃度的鄰苯二酚為底物，在10 μL酶液中加入75 μL終濃度分別為5、10、15、20、25、30 mmol/L的鄰苯二酚反應(yīng)混合液，按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法，在其最適pH的緩沖液中，于37 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀460 nm處測定PPO的活性。用雙倒數(shù)曲線來求取Km值和最大反應(yīng)速率vmax。

1.2.5 銅離子對PPO同工酶活性的影響 取10 μL酶液，加75 μL終濃度分別為 0、0.25×10-7、0.50×10-7、1.00×10-7、2.00×10-7、3.00×10-7 mol/L的Cu2+反應(yīng)混合液，按文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入50 μL 6 mol/L的尿素終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀460 nm處測其活性。

1.3 蛋白電泳方法

1.3.1 非變性蛋白電泳方法 PPO同工酶采用非變性凝膠不連續(xù)垂直板電泳（Native-PAGE）法，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為7.5%，每孔上樣量為20 μL。預(yù)電壓為穩(wěn)壓50 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至穩(wěn)壓110 V，冰浴條件下進(jìn)行電泳。結(jié)束電泳后，將凝膠置于染液（60 mL 1%鄰苯二酚，20 mL 0.6 g/L對苯二胺，20 mL pH 7.2的 0.05 mol/L磷酸緩沖液）中 ，室溫染色30 min后，蛋白膠用去離子水沖洗、浸泡至PPO同工酶帶清晰為止。

1.3.2 變性蛋白電泳方法 PPO蛋白純度采用變性凝膠不連續(xù)垂直板電泳（（SDS-PAGE）法，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，每孔上樣量為20 μL。開始電壓為60 V，在溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)到120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底面1 cm左右時結(jié)束電泳，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色處理。

1.4 PPO同工酶活性測定方法

根據(jù)文獻(xiàn)[22]、[7]的酶活性測定方法，經(jīng)過改進(jìn)進(jìn)行PPO活性測定。具體步驟如下：用移液槍取10 μL PPO酶液加入酶標(biāo)板，再加入0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液50 μL和75 μL反應(yīng)混合液，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，即刻加入50 μL的6 mol/L尿素溶液終止反應(yīng)，然后利用酶標(biāo)儀在460 nm波長處測其吸光值，對照組選用煮沸5～10 min的PPO酶液來代替待測的樣品。反應(yīng)混合液配制方法按0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液∶0.1%脯氨酸∶1%鄰苯二酚=10∶2∶3的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。在試驗測定條件下，將以鄰苯二酚為底物的反應(yīng)液吸光值每分鐘增加0.001定義為1個酶活力單位（U）。

1.5 蛋白濃度測定

用考馬斯亮藍(lán)法測定PPO蛋白濃度，采用蛋白定量試劑盒測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹PPO同工酶純化

茶樹PPO經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠層析進(jìn)行純化后，得到一個單一的同工酶，具體見表1。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，結(jié)果見圖1。從圖1-A可見，該同工酶為單一譜帶，可達(dá)到電泳的純度，PPO單鏈的分子量大小約為53 ku。經(jīng)Native-PAGE電泳，結(jié)果見圖1-B，圖1-B顯示有2條同工酶譜帶。依據(jù)該同工酶在離子交換柱層析中洗脫的順序，將其命名為PPO II。經(jīng)檢測，PPO II的比活力為2 325.39 U/mg，純化倍數(shù)約為1.36倍，活性得率為0.07%。

2.2 抑制劑對PPO II活性的影響

試驗分析了亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸 3種抑制劑對龍井43號茶樹PPO II活性的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可見，抗壞血酸、亞硫酸鈉和L-半胱氨酸均對PPO II活性有抑制作用，并且隨著抑制劑濃度的增加而增強。3種抑制劑對PPO II抑制效果的變化類似；在終濃度0.1 mmol/L之前，3種抑制劑隨濃度的增加，對PPO II活性的抑制效果呈線性增強；至0.1 mmol/L濃度時，3種抑制劑抑制了PPO II 65%以上的酶活性；超過0.1 mmol/L濃度后，3種抑制劑抑制PPO II活性的降低程度趨于平緩。在3種抑制劑中，以抗壞血酸的抑制作用略強，其次為L-半胱氨酸，亞硫酸鈉最弱；當(dāng)抗壞血酸濃度為0.3 mmol/L時，PPOII殘留的酶活性僅為6.98%。

2.3 pH對PPO II活性的影響

試驗分析了不同pH對龍井43號茶樹PPO II活性的影響，結(jié)果見圖3。從圖3可知，PPO II呈現(xiàn)兩個活性峰，一個是在pH 6.0，一個是pH 7.6。但以pH 6.0的PPO II活性更高，約為pH 7.6處的2倍，由此可見PPO II的最適反應(yīng)pH為6.0。

2.4 底物濃度對PPO II活性的影響

試驗還分析了不同鄰苯二酚濃度對PPO II活性的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著底物濃度的增加，在5～25 mmol/L范圍內(nèi)PPO II活性呈上升趨勢。但隨著底物濃度的進(jìn)一步增加，PPO II活性增加幅度逐漸趨于平緩，且在底物濃度為25 mmol/L時酶活性達(dá)到最大。根據(jù)Lineweaver-Burk方程，得出PPO II的Km為13.05 mmol/L，最大反應(yīng)速率vmax為0.019 OD460/min。

2.5 銅離子對PPO II活性的影響

試驗分析了添加不同濃度的Cu2+對龍井43號茶樹PPO II活性的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可知，Cu2+濃度對PPO II活性呈先促進(jìn)后抑制的作用。隨著Cu2+濃度的增加，PPO II活性升高；當(dāng)Cu2+濃度為0.25×10-7 mol/L時出現(xiàn)一個活性峰，隨后活性隨Cu2+濃度的增加而降低。當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到2×10-7 mol/L時，PPO II活性消失，說明同工酶在此Cu2+濃度時完全受到了抑制。

3 討論

3.1 PPO II的肽鏈組成形式

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物和微生物中的PPO同工酶絕大多數(shù)是同源二聚體，僅少數(shù)是單體或其他組成形式[22]?，F(xiàn)在一般也認(rèn)為茶樹PPO同工酶也是同源二聚體，但也有報道在同一茶樹中的PPO同工酶存在單體、二聚體、三聚體等多種形式[10，11]；本試驗中暫未對PPO II的肽鏈構(gòu)成進(jìn)行分析。然而在對經(jīng)過分子篩后的PPO II進(jìn)行Native-PAGE電泳染色時，顯示出有2條活性帶，似表明有2個同工酶。但是試驗在離子交換后的PPO II分離液進(jìn)行非變性膠顯色時，僅有一條活性帶，變性膠顯示也僅一條帶。這表明茶樹PPO II在分離純化后的保存過程中，酶蛋白相互之間可能會產(chǎn)生一種聚合，但酶活性依然可以保留，這還有待于后續(xù)進(jìn)行PPO II全酶分子量的測定以及分子組成形式分析來驗證。

3.2 PPO II的最適反應(yīng)pH

已有報道證明茶樹PPO混合酶的最適反應(yīng)pH為5.6[15，20]，但茶樹體內(nèi)也有單一PPO同工酶的最適反應(yīng)pH為5.6左右的報道[10]，更有人發(fā)現(xiàn)茶樹PPO混合酶的最適反應(yīng)pH不在5.6，而是在8.6左右[16，23]。本試驗中龍井43號茶樹PPO II的最適反應(yīng)pH為6.0，除此之外在pH 7.6時會產(chǎn)生另一個活性峰值。而試驗在以不同pH的緩沖液進(jìn)行龍井43茶樹PPO蛋白粗提過程中，發(fā)現(xiàn)在酸性和堿性條件下均會產(chǎn)生一個酶活性峰值，但以酸性條件下的峰值更高。令人感興趣的是在酸、堿兩種完全不同的條件下，茶樹PPO催化的機理是否完全一致、催化產(chǎn)物方面是否會有所不同還有待于后續(xù)試驗來比較。

3.3 銅離子對PPO II的作用

銅離子是植物PPO催化活性中心的必需因子，已有研究證實銅離子是茶樹PPO的重要組成部分[11，22]。試驗中發(fā)現(xiàn)，Cu2+濃度在0.25×10-7 mol/L時酶活性最高，證實Cu2+可以提高PPO II的活性。而在基因表達(dá)的茶樹PPO蛋白試驗中，發(fā)現(xiàn)Cu2+濃度在1.0×10-7 mol/L時PPO活性最高[5]。這表明Cu2+應(yīng)該是茶樹PPO催化所需的因子。

由于試驗僅對分離純化獲得的一個龍井43號茶樹PPO同工酶進(jìn)行了部分酶學(xué)性質(zhì)研究，局限性不言而喻，還有很多酶學(xué)性質(zhì)方面的問題有待于后續(xù)深入進(jìn)行研究來解決。

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