尹全　李憶　宋君　王東　張富麗　劉文娟　常麗娟　雷紹榮　劉勇

摘要：為建立能同時檢測4種轉(zhuǎn)化體的多重PCR方法，選擇進口轉(zhuǎn)基因玉米最為常見的4種轉(zhuǎn)化體Bt11、Bt176、MON810和MON863，利用國家標準中現(xiàn)行有效的轉(zhuǎn)化體檢測引物作為多重PCR檢測體系引物，對多重PCR退火溫度和引物濃度等進行優(yōu)化。結果表明，多重PCR方法的適宜退火溫度為58 ℃，適宜引物終濃度（μmol/L）配比為0.4∶0.4∶0.4∶0.4，通過建立快速、準確、高效的多重PCR為進口轉(zhuǎn)基因玉米檢測提供有價值的參考。

關鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米；多重PCR；篩查；檢測

中圖分類號：S513 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）06-1540-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.045

轉(zhuǎn)基因玉米就是利用現(xiàn)代分子生物技術，將種屬關系十分遙遠且有用的基因?qū)胄枰牧嫉挠衩走z傳物質(zhì)中，并使其后代表現(xiàn)出人們所追求的具有穩(wěn)定遺傳性狀的玉米[1]。轉(zhuǎn)基因玉米是目前全世界種植最多的4種轉(zhuǎn)基因作物之一[2]。2011年全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積僅次于轉(zhuǎn)基因大豆，達到5 100萬hm2，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的32%[3]。目前，中國批準Bt11、Bt176、MON810、MON863等15種轉(zhuǎn)基因玉米進口用作加工原料[4]。本研究選擇最為常見的轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863 4種轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)基因玉米Bt11是由先正達公司研發(fā)的，為兼具抗蟲害及耐除草劑兩種特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因為Bt系列毒蛋白基因的cry1Ab抗蟲基因，轉(zhuǎn)入的耐草丁膦除草劑基因是草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因[5]。轉(zhuǎn)基因玉米Bt176是由先正達公司研發(fā)的，為具抗蟲害特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因為Bt系列毒蛋白基因的cry1Ab抗蟲基因[6]。轉(zhuǎn)基因玉米MON810是由孟山都公司研發(fā)的，為具抗蟲害特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因為Bt系列毒蛋白基因的cry1Ab抗蟲基因，可抗歐洲玉米螟[7]。轉(zhuǎn)基因玉米MON863是由孟山都公司研發(fā)的，為具抗蟲害特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因為Bt系列毒蛋白基因的cry3Bb1抗蟲基因。

隨著轉(zhuǎn)基因技術不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因商業(yè)化產(chǎn)品不斷增多，其安全性問題也越來越受到社會各界甚至普通大眾的廣泛關注，包括中國在內(nèi)的越來越多國家制定并實施了相關轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識制度[8]，而轉(zhuǎn)基因標識制度如何科學執(zhí)行就必須依托快速、有效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術。目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術主要有蛋白質(zhì)和核酸兩大類，PCR技術是核酸檢測技術的一種，其具有敏感、快速、簡便的特點，主要用于檢測轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品中的外源基因[9，10]，轉(zhuǎn)化體特異也能利用該技術檢測。然而在檢測作物及其產(chǎn)品時，往往需要檢測多個外源基因來確認其是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及含哪些轉(zhuǎn)基因成分或者需要檢測包含多種轉(zhuǎn)化體的樣品，普通PCR（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術分別檢測外源基因或轉(zhuǎn)化體時，存在操作繁瑣、時間和試劑耗費大等缺點[11]。因此，為了解決普通PCR技術在檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品時存在的缺點，多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR）技術在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中得到了應用[12-14]。本試驗旨在提高轉(zhuǎn)化體檢測效率、降低檢測成本，根據(jù)單個轉(zhuǎn)化體檢測方法，建立轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863 4種轉(zhuǎn)化體的多重PCR檢測技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863來源于IRRM[Institute for Reference Materials and Measurements]。

1.1.2 主要試劑 植物基因組提取試劑盒、標準分子量（M）購于天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix購于日本東洋紡（TOYOBO）株式會社；引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.2 引物序列設計

轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON810和MON863轉(zhuǎn)化體特異引物序列參照國家相關標準（表1），將各檢測基因上、下游引物濃度稀釋為10 μmol/L。

1.3 樣品DNA提取

樣品DNA提取按照天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒說明書進行，測定樣品DNA濃度。

1.4 多重PCR方法的建立

1.4.1 單個轉(zhuǎn)化體特異性驗證 反應體系及擴增程序依據(jù)相關標準配制反應，采用Qiagen毛細管電泳儀對反應產(chǎn)物進行結果分析。

1.4.2 多重PCR條件優(yōu)化 利用以下體系和程序?qū)Χ嘀豍CR退火溫度進行優(yōu)化。反應體系為：2×Master Mix 12.5 μL，4對轉(zhuǎn)化體特異引物上、下游引物終濃度各0.2 μmol/L，4個轉(zhuǎn)化體樣品DNA模板各1 mg/L，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度設置梯度50、54、56、58、60、64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用Qiagen毛細管電泳儀對反應產(chǎn)物進行結果分析，按照條帶特異、二聚體少、擴增效率一致等要求選擇適宜的引物退火溫度。

利用以上體系和程序?qū)Χ嘀豍CR引物濃度進行優(yōu)化。PCR反應體系：2×Master Mix 12.5 μL，4對引物終濃度按照表2設置引物濃度梯度，4個轉(zhuǎn)化體樣品DNA模板各1 mg/L，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序選擇退火溫度優(yōu)化后確定的程序。采用Qiagen毛細管電泳儀對反應產(chǎn)物進行結果分析，按照條帶特異、二聚體少、擴增效率一致等要求選擇適宜的引物濃度配比。

1.5 多重PCR方法靈敏度檢測

將4個轉(zhuǎn)化體樣品DNA模板等比混合，將混合后的DNA模板進行梯度稀釋，使得每個反應體系中基因組DNA的拷貝數(shù)分別為1 000、200、100、50、20、10個，利用試驗優(yōu)化后的多重PCR方法進行靈敏度試驗。

1.6 已知樣品驗證

利用試驗優(yōu)化后的MPCR檢測體系，對已知樣品進行驗證。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA提取

樣品總DNA提取純化采用植物基因組提取試劑盒，通過NanoDrop 1000（Thermo scientific）超微量分光光度計測定濃度和質(zhì)量。結果表明，所有樣品濃度都大于25 ng/μL，且OD260 nm/OD280 nm范圍為1.8～2.0，OD260 nm/OD230 nm大于2.0，提取的樣品DNA可滿足PCR擴增對模板DNA的要求[19]，將樣品DNA濃度稀釋至25 ng/μL待測。

2.2 單個轉(zhuǎn)化體特異性驗證

本試驗選擇的單個轉(zhuǎn)化體PCR檢測方法可以將目的基因片段成功擴增，而其他不含該轉(zhuǎn)化體的樣品中沒有相應擴增，結果（圖1）表明，4個轉(zhuǎn)化體引物目的條帶特異，沒有非特異性條帶出現(xiàn)，在國家標準的基礎上進一步說明本試驗選擇的4個轉(zhuǎn)化體引物可用于多重PCR檢測體系研究。

2.3 多重PCR條件的優(yōu)化

結果（圖2）表明，退火溫度太低容易產(chǎn)生非特異性條帶和引物二聚體，而退火溫度太高又不能使全部目的條帶得到理想擴增。當退火溫度為50 ℃時，所有目的條帶都未得到擴增，而且還出現(xiàn)了許多非特異性條帶，退火溫度50 ℃是不適合的。當退火溫度為54和56 ℃時，雖然所有目的條帶都得到擴增，但也出現(xiàn)了許多非特異性條帶，退火溫度54和56 ℃也是不適合的。而退火溫度為64 ℃時，Bt11轉(zhuǎn)化體的目的條帶未得到有效擴增，退火溫度64 ℃也不適合。當退火溫度為58和60 ℃時，目的條帶得到擴增，且沒有出現(xiàn)非特異條帶，考慮到所有目的條帶擴增效率和單基因擴增時的退火溫度，因此，選擇多重PCR反應的適宜退火溫度為58 ℃。

通過引物濃度梯度試驗，結果（圖3）表明，各引物終濃度按照方案F配比時，各轉(zhuǎn)化體目的條帶的擴增效率高并且一致，沒有非特異性條帶出現(xiàn)；而其他幾種引物濃度方案結果均不理想，目的基因存在無擴增、擴增效率不一致以及出現(xiàn)非特異條帶現(xiàn)象等。因此，最終確定適宜的引物終濃度（μmol/L）配比為0.4∶0.4∶0.4∶0.4。

2.4 多重PCR靈敏度結果

結果（圖4）表明，在模板濃度不低于100個拷貝時，4個轉(zhuǎn)化體目的條帶均可得到有效擴增。而當模板濃度低于100個拷貝時，4個轉(zhuǎn)化體目的條帶幾乎沒有擴增。本試驗所建立的多重PCR檢測體系靈敏度可達100個拷貝。

2.5 已知樣品驗證

采用優(yōu)化后的多重PCR體系對已知樣品進行檢測，結果（圖5）表明，所有已知樣品的擴增條帶與其含有的轉(zhuǎn)化體一致，該結果進一步驗證了建立的多重PCR檢測方法的可靠性。

3 小結與討論

多重PCR最早由Chamberlain等[12]于1988年提出，目前已被廣泛應用于醫(yī)學及生物等領域，包括基因敲除分析、多態(tài)性分析、定量分析、RNA檢測及微生物耐藥檢測等[20]。在實際應用中，不同引物序列對多重PCR結果存在很多影響因素（如引物濃度、退火溫度等）。在關鍵影響因素引物濃度選擇過程中，本試驗采用不同引物濃度梯度和引物配比，在充分考慮PCR反應過程中易產(chǎn)生的引物二聚體、非特異性條帶等特殊情況下，選擇目的條帶特異、引物二聚體少，各轉(zhuǎn)化體引物擴增效率相對一致的引物濃度配比。退火溫度是多重PCR反應中一個關鍵因素。通常情況下可以依據(jù)引物的解鏈溫度直接選擇退火溫度，但有時結果與預期并不一致。在多重PCR反應條件優(yōu)化過程中，最簡單的方法就是設置54 ℃為初始退火溫度，如果多重PCR擴增產(chǎn)生非特異性條帶，需適當提高引物退火溫度，反之則降低引物退火溫度[21]。本試驗從6個退火溫度中，根據(jù)4個轉(zhuǎn)化體引物特異性條帶擴增效率、非特異性條帶以及引物二聚體的產(chǎn)生等因素確定了58 ℃作為轉(zhuǎn)化體多重PCR檢測體系退火溫度。

為了提高檢測效率，本試驗將分辨率更高、電泳條帶更清晰的毛細管電泳引入到多重PCR檢測體系中，也是本研究的最大特點。目前毛細管電泳技術已應用于無機及有機化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、肽的分離分析，核酸的分離分析等方面[22]。雖然目的條帶間堿基差異大也可以采用普通瓊脂糖凝膠電泳方法進行分析判斷，但毛細管電泳能將擴增目的條帶分離得更明顯，結果更加清晰；如果需要檢測的目的基因間的堿基差異大小不能采用普通瓊脂糖凝膠電泳方式進行準確分析，特別是在只有幾個堿基差異時，毛細管電泳的優(yōu)勢則更明顯。

本試驗建立的轉(zhuǎn)化體多重PCR檢測方法，可實現(xiàn)在1個反應體系中同時檢測4種轉(zhuǎn)化體，有效簡化了操作步驟、縮短了檢測時間、提高了檢測效率，為轉(zhuǎn)基因玉米檢測提供了速度快、效率高、成本低以及污染小的方法。

參考文獻：

[1] 李余良，胡建廣.轉(zhuǎn)基因玉米研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2006，22（2）：71-75.

[2] JAMES C.2014年全球生物技術/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J].中國生物工程雜志，2015，35（1）：1-14.

[3] JAMES C.2011年全球生物技術/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J].中國生物工程雜志，2012，32（1）：1-14.

[4] 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室.2004-2011年進口用作加工原料的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物審批情況[EB/OL].http：//www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/201202/P020130618408715248212.pdf.

[5] 覃 文，曹際娟，朱水芳.加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因玉米Bt11成分實時熒光PCR定量（性）檢測[J].生物技術通報，2003，19（6）：46-50.

[6] 李蔥蔥，王青山，李飛武，等.用實時熒光PCR方法定量檢測Bt176轉(zhuǎn)基因玉米[J].吉林農(nóng)業(yè)科學，2007，32（5）：24-27.

[7] 曹際娟，曹遠銀.PCR對轉(zhuǎn)基因玉米MON810鑒定檢測[J].玉米科學，2003，11（1）：19-21.

[8] 金蕪軍，賈士榮，彭于發(fā).不同國家和地區(qū)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識管理政策的比較[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報，2004，12（1）：1-7.

[9] 尹 全，宋 君，劉 勇.生物技術作物食品檢測技術研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2010，22（5）：135-137.

[10] 張富麗，雷紹榮，劉 勇.轉(zhuǎn)基因作物及加工品檢測技術概述[J].生物技術通訊，2009，20（5）：733-737.

[11] 鄭景生，呂 蓓.PCR技術及實用方法[J].分子植物育種，2003， 1（3）：381-394.

[12] CHAMBERLAIN J S，GIBBS R A，RANIER J E，et al. Detection screening of the duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA implication[J]. Nucleic Acids Res，1988，16：1141-1156.

[13] 自 月，才 華，奕風俠，等.多重PCR結合DHPLC方法檢測番茄中轉(zhuǎn)基因成分[J].作物雜志，2011（2）：28-31.

[14] GERMINI A，ZANETTI A，SALATI C，et al. Development of a seven target multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean and in feeds and foods[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（11）：3275-3280.

[15] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部869號公告-3-2007，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt11及其衍生品種定性PCR方法[S].

[16] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部2122號公告-15-2014，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲和耐除草劑玉米Bt176及其衍生品種定性PCR方法[S].

[17] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部2122號公告-16-2014，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲玉米MON810及其衍生品種定性PCR方法[S].

[18] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部869號公告-10-2007，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲玉米MON863及其衍生品種定性PCR方法[S].

[19] 李 憶.多重PCR方法同時檢測3種轉(zhuǎn)基因作物外源基因[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014，44（22）：14-16.

[20] 趙紅慶，苑錫銅，黃留玉.多重PCR技術在病原檢測中的應用[J].生物技術通訊，2007，8（5）：863-866.

[21] HENEGARIU O，HEEREMA N A，DLOUHY S R，et al. Multiplex PCR： Critical parameters and step-by-step protocol[J]. Biotechniques，1997，23（3）：504-511.

[22] 陳 義.毛細管電泳技術及應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2000.