呼鳳蘭，賀瑩，趙建英

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000）

富鉻酵母誘變及突變株篩選研究

呼鳳蘭，賀瑩，趙建英

（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000）

主要通過3種誘變方式對(duì)酵母進(jìn)行誘變，這些誘變方式包括紫外照射、化學(xué)劑誘變和復(fù)合誘變，并篩選出高產(chǎn)耐鉻菌株。結(jié)果表明：通過紫外誘變，當(dāng)誘變時(shí)間為100 s時(shí)，致死率達(dá)到80%，所以把100 s確定為最佳誘變時(shí)間，并篩選出了5株菌株，分別命名為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5；通過不同體積分?jǐn)?shù)的DES對(duì)酵母進(jìn)行誘變，最佳致死劑量是體積分?jǐn)?shù)為4%的DES，與此同時(shí)，在這個(gè)酵母誘變過程當(dāng)中，5株菌株被篩選分離出來；對(duì)酵母進(jìn)行復(fù)合誘變時(shí)，選用4%的DES對(duì)待處理的菌樣進(jìn)行處理，處理時(shí)間為25 min，再利用紫外照射對(duì)菌懸液照射60 s，篩選出長(zhǎng)得好的10只菌株，命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10；針對(duì)上述經(jīng)過單一誘變和復(fù)合誘變的菌株進(jìn)行第二次篩選，選出鉻含量高的菌株F1、F2、F6、F9、Z1，其中F9的鉻含量最高，達(dá)到13.4 mg/g。

鉻；酵母；誘變；篩選

鉻作為一種對(duì)生物體有著不可或缺作用的微量元素。對(duì)人來講，隨著年齡的增大，生物代謝速度的減緩，伴隨細(xì)胞死亡，鉻在生物體內(nèi)的含量逐漸減少。雖然人體內(nèi)鉻含量很少，人體對(duì)其鉻的需求量小，但是鉻對(duì)人體的作用是至關(guān)重要的［1］。鉻能夠幫助胰島素放大其功能效應(yīng)，不僅能夠加快細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收速度，使人體在代謝過程中產(chǎn)生一系列的中間產(chǎn)物，進(jìn)入不同的代謝途徑，產(chǎn)生大量的ATP（三磷酸腺苷），為人體的日?；顒?dòng)提供大量的能量，而且能夠降低血糖濃度，因此被稱作一種血糖調(diào)節(jié)劑。作為人體內(nèi)一種重要的血糖調(diào)節(jié)劑，在血糖濃度調(diào)節(jié)方面，特別是對(duì)糖尿病患者而言有著不可言喻的重要作用［2］。除了在血糖調(diào)節(jié)方面有著重要地位外，鉻在人體的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)面又有著其他微量元素不可替代的作用。鉻既有助于生長(zhǎng)發(fā)育，還對(duì)血液中的一些激素有控制作用。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)國(guó)外對(duì)微量元素的吸收越來越關(guān)注。能夠富集微量元素酵母必然會(huì)引起人們的注意。酵母的這種能夠富集微量元素的性能給科學(xué)家們提供了無限的想象空間，使得他們?cè)诳茖W(xué)研究上看到了在人體微量元素吸收方面的一縷曙光。在日常食用方面，酵母富鉻食品漸漸深入人們的生活。富鉻酵母食品的出現(xiàn)使得國(guó)內(nèi)外的專家開始思考，將本來就不易于吸收的鉻加入到各類食品中，通過轉(zhuǎn)基因的手段將富鉻酵母的基因插入到各類蔬菜水果當(dāng)中，讓人們不再因?yàn)槿便t而導(dǎo)致生病甚至死亡，讓人們不再擔(dān)心缺鉻［3］。此次實(shí)驗(yàn)是在前人的研究基礎(chǔ)上來對(duì)酵母富集鉻進(jìn)行的的深入研究，主要是利用紫外線誘變、化學(xué)誘變、復(fù)合誘變3種手段來對(duì)富含Cr3+的酵母進(jìn)行傳代培養(yǎng)，篩選分離出好菌株［4］。以便使富鉻酵母進(jìn)一步滿足工業(yè)生產(chǎn)化需求，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1主要試劑

酵母菌：呂梁學(xué)院生命科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室提供。

液體培養(yǎng)基：即PDA培養(yǎng)基（potato dextrose agar）：馬鈴薯200 g（煮汁），葡萄糖20 g，無菌水1 L，pH自然。

固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加蛋白胨10 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基：配方同液體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基分裝到容量為250 mL的搖瓶中，每個(gè)搖瓶中加900 μg/mL的鉻。

篩選平板培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中將不同濃度梯度的鉻加入其中。

硫酸二乙酯（DES）、鹽酸、高氯酸、硝酸、75%乙醇、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、鉻標(biāo)準(zhǔn)液、三氯化鉻、磷酸二氫鉀、無水乙醇、硫酸鎂、瓊脂粉、葡萄糖一水、硫酸鎂、蛋白胨、氫氧化鈉：山西航科試劑有限公司。

1.2主要儀器

KDM型控溫電熱套：山東鄄城華魯儀器公司；TX323L型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Neofuge 13型臺(tái)式高速離心：上海力申科學(xué)儀器有限公司；ZYW-100D型恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZXSD型生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；CSIO UV4C型多用臺(tái)式暗箱紫外分析儀：北京賽百奧科技有限公司；XH-C型漩渦混合器：金壇市白塔新寶儀器廠；VIS-723N型紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司；G-2X-9146MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3方法

1.3.1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

先將冷藏的菌種取出，用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上挑一環(huán)菌，接種在液體培養(yǎng)基中，放在振蕩培養(yǎng)箱中，把溫度設(shè)置成28℃，轉(zhuǎn)速設(shè)成180 r/min，在此種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，每隔2 h從培養(yǎng)基中取2 mL菌液在600 nm處測(cè)吸光度［5］。

1.3.2菌體濃度的測(cè)定

用血球計(jì)數(shù)板來計(jì)數(shù)。

1.3.3誘變育種

1.3.3.1菌種的活化

將菌株連續(xù)傳代兩次，此時(shí)菌體就已經(jīng)活化，可以使用［6］。

1.3.3.2酵母細(xì)胞懸液的制備

挑一環(huán)活化好的菌接種于上述液體培養(yǎng)基中，設(shè)置恒溫振蕩培養(yǎng)箱的溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，然后從中取適量菌液于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，至鏡檢細(xì)胞濃度為1 mL菌液含有106個(gè)酵母菌［7］。從培養(yǎng)基中取1 mL于1.5 mL的離心管中，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速在臺(tái)式高速離心機(jī)中離心10 min，用無菌水將菌體輕輕沖洗兩三次，并用振蕩器振蕩成菌懸液。

1.3.3.3紫外線照射

紫外照射誘變用波長(zhǎng)為365 nm的紫外線進(jìn)行照射，每隔20 s取1 mL照射過的菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)梯度都要用振蕩器把菌液振蕩均勻，然后使用移液槍分別取0.1 mL的菌懸液滴在平板中，用涂布器進(jìn)行涂布分離，鑒于菌體濃度達(dá)到106個(gè)/mL，涂布時(shí)涂10-4、10-5、10-63個(gè)稀釋度作為試驗(yàn)的空白對(duì)照，涂10-3、10-4、10-53個(gè)稀釋度作為試驗(yàn)的誘變組。誘變后，在生化培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)條件下，避光培養(yǎng)，36 h之后，待菌落長(zhǎng)出，在菌落計(jì)數(shù)器下進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算不同條件下的致死率，以致死率75%～80%的照射時(shí)間作為最佳誘變條件［8］。

1.3.3.4硫酸二乙酯（DES）誘變

將菌懸液分別轉(zhuǎn)入已經(jīng)加入16 mL磷酸緩沖液的50 mL錐形瓶中，接著再將體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%的DES 1 mL分別加入錐形瓶中，振蕩處理50 min后分別加入20 mL 25%硫代硫酸鈉溶液使反應(yīng)停止，后續(xù)過程同紫外線照射操作方法［9］。

1.3.3.5復(fù)合誘變

將菌懸液轉(zhuǎn)入50 mL錐形瓶中，加入16 mL磷酸緩沖液，再加體積分?jǐn)?shù)為4%DES 1 mL，振蕩處理25 min后加入20 mL 25%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，用提前準(zhǔn)備好的高壓蒸汽滅菌鍋滅過菌的培養(yǎng)皿平板，使用移液槍取5 mL的上述經(jīng)過DES處理過的菌懸液于此平板中，將平皿放在臺(tái)式暗箱紫外分析儀中，取下平皿蓋，用波長(zhǎng)為365 nm的紫外線進(jìn)行照射，二者相距30 cm，照射60 s，后續(xù)過程同1.3.3.3［10］。

1.3.4篩選方法

初篩：試驗(yàn)所用樣品經(jīng)過上述物理誘變、化學(xué)誘變和復(fù)合誘變3種不同方式的誘變之后，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，環(huán)境為30℃，180 r/min搖床內(nèi)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)6 h，計(jì)數(shù)菌體數(shù)量級(jí)為106個(gè)/mL，用移液槍精確吸取菌液1 mL，對(duì)其進(jìn)行離心，在一系列的梯度稀釋后，在含有不同濃度Cr3+的經(jīng)過篩選的培養(yǎng)皿平板上，吸取0.1 mL的菌液進(jìn)行接種。其濃度分別是600、700、800、900、1 000 μg/mL。每個(gè)稀釋梯度分別用涂布器涂布3～5個(gè)培養(yǎng)皿平板。涂好平板后，在生化培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)條件下，24 h之后，待菌落長(zhǎng)的明顯后，挑選長(zhǎng)勢(shì)較好菌落明顯的菌，即能在較高Cr3+平板上生長(zhǎng)的菌株，傳代兩次。在冰箱中進(jìn)行菌種低溫保藏，以便后期復(fù)篩使用［11］。

復(fù)篩：將初篩低溫保藏的菌株分別取一環(huán)接入三角燒瓶中，三角瓶裝100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為210 r/min，在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，待培養(yǎng)結(jié)束后的菌液離心、干燥測(cè)其生物量，測(cè)其鉻含量。同時(shí)，將原菌株在同樣條件下進(jìn)行發(fā)酵，用以比較各誘變菌株與原始菌株生物量和鉻含量［12］。

1.3.5鉻標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精確吸取標(biāo)準(zhǔn)鉻使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加2 mL2%的鹽酸，定容到100 mL。用原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)試，在計(jì)算機(jī)上設(shè)置測(cè)試條件為：燈電流I=3 mA，狹縫=0.4 nm，波長(zhǎng)=357.9 nm，燃燒器高度=8 mm，空氣流量=7 L/min，乙炔氣流量=2.5 L/min，空氣壓力=0.3 MPa，乙炔壓力=0.09 MPa，用測(cè)定的吸光度值，得出鉻的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

鉻標(biāo)準(zhǔn)使用液：配制濃度為為100 μg/mL Cr3+的溶液。

1.3.6總鉻的初步測(cè)定

在接種之前，分別從20瓶配制好液體培養(yǎng)基中取出10 mL培養(yǎng)基于20支15 mL離心管中，作為對(duì)照組，以上述震蕩培養(yǎng)條件為準(zhǔn)，待菌搖床培養(yǎng)24 h后，重復(fù)初篩的操作步驟，3 000 r/min，20min進(jìn)行離心，取出上清液放入試管內(nèi)，作為試驗(yàn)所需要的樣品。測(cè)定吸光度，在計(jì)算機(jī)上設(shè)置測(cè)試條件為：燈電流I=3 mA，狹縫=0.4 nm，波長(zhǎng)=357.9 nm，燃燒器高度=8 mm，空氣流量=7 L/min，乙炔氣流量=2.5 L/min，空氣壓力= 0.3 MPa，乙炔壓力=0.09 MPa，火焰類型：還原性黃色焰。測(cè)定接種前和接種后上清液的吸光度A和B，則A-B是初步測(cè)定的酵母吸收的鉻含量。

1.3.7生物量的測(cè)定

取45 mL試驗(yàn)所得的菌液放入離心管中，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心12 min，加入適量超純水振蕩，使富鉻酵母沒有沉淀，再次離心。此步驟反復(fù)兩次，收集沉淀物，在60℃烘箱中烘24 h后稱重，推斷出100 mL菌液的生物量，即富鉻酵母所測(cè)生物量［12］。

1.3.8總鉻的測(cè)定

在研缽中，放入試驗(yàn)所得到的富鉻酵母，進(jìn)行研磨，得到富鉻酵母粉。稱取0.1 g～0.2 g鉻酵母加碳酸鈉進(jìn)行加熱，蒸干其中水分，調(diào)低溫度將其中的水慢慢蒸發(fā)至只有固體的灰分，在600℃馬弗爐中進(jìn)行對(duì)試驗(yàn)所得的灰分進(jìn)行灰化6 h后，出現(xiàn)白色或淡黃色的固體，一段時(shí)間后至冷卻，使用蒸餾水沖洗馬弗爐，待沖洗干凈后，將沖洗液體倒入50 mL的標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中并定容，測(cè)得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鉻含量。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的生長(zhǎng)曲線

酵母菌生長(zhǎng)曲線見圖1。

圖1　酵母菌生長(zhǎng)曲線Fig.1Yeast growth curve

從圖1的酵母生長(zhǎng)曲線可以看出，該菌在6 h生長(zhǎng)速率最快，達(dá)到對(duì)數(shù)期，這時(shí)的菌最敏感，取這個(gè)時(shí)期的菌進(jìn)行誘變，24 h達(dá)到穩(wěn)定期。

2.2紫外照射的致死率

酵母菌紫外致死曲線見圖2。

圖2　酵母菌紫外致死曲線Fig.2Yeast UV lethal curve

從圖2中的酵母菌紫外致死曲線可以看出，照射時(shí)間不斷延長(zhǎng)，致死率不斷提高，當(dāng)照射時(shí)間為100 s時(shí)，致死率達(dá)到80%，因此確定100 s為最佳誘變時(shí)間。從100 s后，致死率趨于平緩，達(dá)到90%。

2.3DES誘變的致死率

酵母菌化學(xué)誘變致死曲線見圖3。

圖3　酵母菌化學(xué)誘變致死曲線Fig.3Yeast chemical mutagenesis lethal curve

從圖3中可以看出，隨著化學(xué)劑量的增大，致死率越來越高，當(dāng)DES劑量為4%時(shí)的致死率為80%，4%為最佳劑量。同時(shí)篩出5株長(zhǎng)得好的菌株，分別為H1、H2、H3、H4、H5。

2.4復(fù)合誘變

經(jīng)4%DES化學(xué)誘變后，再經(jīng)紫外誘變60 s，在篩選培養(yǎng)基上900 μg/mL鉻濃度菌長(zhǎng)得最好，在鉻濃度為1 000 μg/mL情況下，培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出的菌較小，因此將900 μg/mL鉻濃度確定為復(fù)篩時(shí)最佳的鉻添加量。將復(fù)合誘變后的菌株篩出10株，分別為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10。

2.5鉻標(biāo)準(zhǔn)曲線

鉻的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4　鉻的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4Standard curve of chromium

2.6對(duì)鉻富集能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行篩選

對(duì)鉻富集能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行篩選見表1。

從表1中可以得知，富鉻能力強(qiáng)的菌株有F1，F(xiàn)2，F(xiàn)6，F(xiàn)9，Z1 5株，其中F9菌株鉻含量達(dá)13.4 mg/g。

3　結(jié)論

本課題組確定取培養(yǎng)6 h即處于對(duì)數(shù)時(shí)期的菌進(jìn)行誘變，單因素誘變過程中確定紫外線最佳誘變劑量為100 s。DES最佳誘變劑量為4%。經(jīng)過單一誘變和復(fù)合誘變的菌株進(jìn)行第二次篩選，選出鉻含量高的菌株F1、F2、F6、F9、Z1，其中F9的鉻含量最高，達(dá)到13.4 mg/g，比誘變前提高了2.74倍。

表1　篩選富集鉻的菌株Table 1Screening enriched chromium strong strain

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Mutation of Chromium-rich Yeast and Isolation of Mutants

HU Feng-lan，HE Ying，ZHAO Jian-ying
（Department of Life Science，Lvliang College，Lvliang 033000，Shanxi，China）

This research mainly through three mutagenesis ways to mutagenesis of yeast，the mutagenic methods including ultraviolet irradiation，chemical mutagenesis and compound mutagenesis，and filter out high-yield strains of resistant chromium.The results showed that：through ultraviolet mutagenesis，when mutagenesis time of 100 s，the fatality rate was 80%，so100 s was the best mutation time，and five strains（Z1，Z2，Z3，Z4，Z5）were screened；mutagenic yeast by different concentrations of DES（硫酸二乙酯），best lethal dose was the volume fraction 4%of DES，at the same time，during the process of yeast mutagenesis，five strains were isolated and screened out.When yeast compound mutation，bacteria samples treated with 4%of DES，the processing time was 25 min，and then irradiated with ultraviolet bacterial suspension 60 s，good-growing ten strains（F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5，F(xiàn)6，F(xiàn)7，F(xiàn)8，F(xiàn)9，F(xiàn)10）were screened；screening of strains again aftering a single mutation and composite mutagenesis，selected chromium-rich strains F1，F(xiàn)2 and F6，F(xiàn)9，Z1，which the F9 chromium content was the highest，reached 13.4 mg/g.

chromium；yeast；mutation；screening

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.035

2016-03-03

呂梁學(xué)院科研基金項(xiàng)目資助（ZRQN201403）；山西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（2015456）；呂梁學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（CXCYZD201503）

呼鳳蘭（1980—）女（漢），講師，碩士，研究方向：生物學(xué)。