王　琳，王　雪，田靜秒

（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，北京 101200）

羅丹明B酶聯(lián)免疫分析方法的建立與應(yīng)用

王琳，王雪，田靜秒

（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，北京 101200）

建立一種用于檢測(cè)羅丹明B的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法。該方法的IC50為1.3ng/mL，檢測(cè)限為0.786ng/g。該方法檢測(cè)豆瓣醬，加標(biāo)濃度5ng/g，平均回收率為83%，加標(biāo)濃度10ng/g，平均回收率為89%；檢測(cè)辣椒醬，加標(biāo)濃度5ng/g，均回收率為88%，加標(biāo)濃度10ng/g，平均回收率為104%；檢測(cè)辣椒油，加標(biāo)濃度5ng/g，平均回收率為94%，加標(biāo)濃度10ng/g，平均回收率為101%；檢測(cè)辣椒粉，添加濃度5ng/g，平均回收率為82%，加標(biāo)濃度10ng/g，平均回收率為90%。該方法的平均批內(nèi)差為9.0%，批間差為10.5%，與其他常見染料未見交叉反應(yīng)。該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于羅丹明B的現(xiàn)場(chǎng)大量樣品快速檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫分析法；羅丹明B；豆瓣醬；辣椒醬；辣椒油；辣椒粉

0　引　言

羅丹明B（Rhodamine B，RhB）是一種鮮桃紅色人工合成染料，為致癌物質(zhì)［1］。2008年衛(wèi)生部發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》，明確規(guī)定禁止在食品中添加羅丹明B類工業(yè)染料。因此，建立一種快速靈敏的檢測(cè)食品中非法添加的羅丹明B的方法非常必要。

目前，羅丹明B的檢測(cè)主要是儀器分析，如高效液相-熒光檢測(cè)法［2-3］和高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法［4］，而免疫分析相關(guān)產(chǎn)品在市場(chǎng)上較少。但實(shí)驗(yàn)室分析用儀器設(shè)備及其運(yùn)行維護(hù)成本較高，對(duì)操作人員的專業(yè)要求也較高。酶聯(lián)免疫分析較儀器分析更具優(yōu)勢(shì)。

目前，已有蘇丹紅［5］、孔雀石綠［6］等染料的酶聯(lián)免疫分析方法，而采用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)羅丹明B的相關(guān)報(bào)道很少。宋姍姍等［7］建立了一種羅丹明B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)辣椒粉中的羅丹明B，回收率為68.1%到89.3%。Michalina Oplatowska等［8］建立了羅丹明B與甲基黃的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，檢測(cè)調(diào)味醬與香料中的羅丹明B與甲基黃，可以檢測(cè)出10 ng/g的羅丹明B與15 ng/g的甲基黃。本研究針對(duì)成分復(fù)雜、狀態(tài)粘稠的實(shí)際樣品，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行研究與改進(jìn)，建立了一種更加靈敏、便捷地檢測(cè)羅丹明B含量的酶聯(lián)免疫方法，驗(yàn)證了該方法在檢測(cè)豆瓣醬等調(diào)味品中的羅丹明B含量方面的應(yīng)用。

1　試劑與材料

1.1試劑

羅丹明B單克隆抗體，與羅丹明B合成抗原購于廣州優(yōu)抗多生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)羊抗鼠二抗購于Jackson公司；顯色液A、顯色液B與終止液購于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白購于北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑購于西隴化工股份有限公司。

1.2材料與設(shè)備

96孔可拆卸酶標(biāo)板購于中生華美（北京）科技有限公司。酶標(biāo)儀，Thermo Scientific。

2　方　法

1）包被：羅丹明B合成抗原包被96孔板，包被量為每孔100μL，4℃過夜；用洗滌液洗滌3次，每次300μL/孔，拍干。2）封閉：每孔加入200μL封閉液，37℃溫育3h；用洗滌液洗滌3次，每次300 μL/孔，拍干。3）加樣：每孔依次加入樣品，酶標(biāo)二抗，與羅丹明B單克隆抗體，各50μL；4）孵育：室溫孵育30min后，用洗滌液洗滌5次。5）顯色：每孔加入顯色液A與顯色液B各50μL，室溫避光作用15min。6）每孔加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其450 nm處的OD值。

2.2ELISA方法的建立與優(yōu)化

1）用碳酸鹽緩沖液（CB）將RhB合成抗原分別稀釋5000，10000，20000倍，用于包被，按照表1進(jìn)行操作，以確定抗原的最佳包被濃度。2）用磷酸鹽緩沖液（PBS）將RhB單克隆抗體分別稀釋5 000，10 000和20000倍，用于反應(yīng)，按照表1進(jìn)行操作，以確定抗體的最佳反應(yīng)濃度。3）用PBS將酶標(biāo)二抗分別稀釋1 000和2 000倍，用于反應(yīng)，按照表1進(jìn)行操作，以確定酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)濃度。將IC50作為評(píng)價(jià)ELISA參數(shù)優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)，IC50越低說明靈敏度越高［9］，IC50為使抑制率達(dá)到50%時(shí)的RhB濃度。

2.3方法靈敏度

該方法的靈敏度由檢測(cè)限表示，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法試劑（盒）的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)［10］，檢測(cè)限的檢測(cè)方法為：用樣品稀釋液重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算吸光度平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），以及M-2SD所對(duì)應(yīng)的吸光度值；將M-2SD所對(duì)應(yīng)的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到的結(jié)果即為方法檢測(cè)限。

通路分析是通過對(duì)選定的基因按照公共數(shù)據(jù)庫KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行分類，通過離散分布的顯著性分析，得到與實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠酗@著相關(guān)的通路分類，本研究利用通路在線分析平臺(tái)Omicshare（http://www.omicshare. com）以P＜0.5、FDR＜0.05為參數(shù)獲得鉤藤散治療AD相關(guān)基因的通路富集信息，并使用Cytoscape-v3.6.1構(gòu)建靶點(diǎn)-通路（T-P）網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4樣品前處理方法優(yōu)化

豆瓣醬樣品采用3種方法進(jìn)行前處理：1）豆瓣醬樣品均質(zhì)后，加入乙腈提取，振蕩，離心后取上清液，氮?dú)獯蹈?，再加入樣品稀釋液?fù)溶，取50μL復(fù)溶后的溶液檢測(cè)。2）豆瓣醬樣品均質(zhì)后，加入乙腈與正己烷提取，振蕩，離心后取乙腈相，氮?dú)獯蹈?，再加入樣品稀釋液?fù)溶，取50μL復(fù)溶后的溶液檢測(cè)。3）豆瓣醬樣品均質(zhì)后，依次加入水、乙腈與正己烷提取，振蕩，離心后取乙腈相，氮?dú)獯蹈桑偌尤霕悠废♂屢簭?fù)溶，取50μL復(fù)溶后的溶液檢測(cè)。

取1g豆瓣醬，分別添加5ng與10ng羅丹明B，按照上述3種方法進(jìn)行前處理，計(jì)算加標(biāo)回收率，回收率越接近100%，檢測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確。

2.5方法加標(biāo)回收率

取1g豆瓣醬或辣椒醬，分別添加5，10 ng羅丹明B，均質(zhì)，加入1mL水，劇烈振蕩混勻；再加入4mL乙腈，劇烈振蕩30 s；再加入5 mL正己烷，劇烈振蕩5 min；離心后取1 mL乙腈相；氮?dú)獯蹈?；再加?mL樣品稀釋液復(fù)溶；取50μL復(fù)溶后的溶液檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算加標(biāo)回收率與回收率的變異系數(shù)。

取1g辣椒油，分別添加5，10ng羅丹明B，均質(zhì)；加入4mL乙腈，劇烈振蕩30s；再加入5mL正己烷，劇烈振蕩5 min；離心后取1 mL乙腈相；氮?dú)獯蹈?；再加?mL樣品稀釋液復(fù)溶；取50μL復(fù)溶后的溶液檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算加標(biāo)回收率與回收率的變異系數(shù)。

取1g辣椒粉，分別添加5，10ng羅丹明B，均質(zhì)；加入5mL乙腈，劇烈振蕩30s；再加入5mL正己烷，劇烈振蕩5 min；離心后取1 mL乙腈相；氮?dú)獯蹈?；再加?mL樣品稀釋液復(fù)溶；取50μL復(fù)溶后的溶液檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算加標(biāo)回收率與回收率的變異系數(shù)。

2.6方法批內(nèi)差與批間差

制備3批羅丹明B的酶聯(lián)免疫分析試劑，用于檢測(cè)豆瓣醬中的羅丹明B，樣品分別使用3批試劑檢測(cè)，每批試劑檢測(cè)10次，計(jì)算批內(nèi)差與批間差。

2.7方法特異性

選擇5種常用染料：蘇丹紅，酸性橙II，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22，配制成不同質(zhì)量濃度（1000，2000，5000，10000ng/mL）的溶液，檢測(cè)其與羅丹明B的交叉反應(yīng)率。

3　結(jié)果與分析

3.1ELISA方法的建立與優(yōu)化

檢測(cè)不同包被條件與反應(yīng)條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50如表1所示?？梢源_定，抗原的最佳包被濃度為稀釋10000倍（終濃度為1μg/mL），單克隆抗體的最佳反應(yīng)濃度為稀釋20 000倍（終濃度為0.5 μg/mL），酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)濃度為稀釋1 000倍（終濃度為1μg/mL）。

表1　不同條件下的IC50值

根據(jù)最佳條件檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性范圍為0.3～8.1ng/mL，IC50為1.3ng/mL。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2方法靈敏度

檢測(cè)樣品稀釋液的吸光度值，計(jì)算吸光度值的M-2SD所對(duì)應(yīng)的吸光度值為1.996，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的濃度為0.786ng/g，因此該方法的檢測(cè)限為0.786ng/g。進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，液相色譜-熒光法及液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的檢測(cè)限均為0.005mg/kg［11］，可見該方法的檢測(cè)限可以滿足檢測(cè)羅丹明B的要求。

3.3前處理方法優(yōu)化

豆瓣醬按照2.4的3種方法進(jìn)行前處理，加標(biāo)回收率如表2所示。由表可知，依次加入水、乙腈、正己烷提取是最優(yōu)的前處理方法，檢測(cè)結(jié)果最準(zhǔn)確。羅丹明B易溶于甲醇、乙腈等極性較強(qiáng)的溶劑、在正己烷、氯仿等極性較弱的溶劑中溶解度較小，因此采用乙腈提取。豆瓣醬中含有脂類雜質(zhì)，可能會(huì)干擾檢測(cè)，因此在樣品前處理時(shí)加入正己烷，除去脂類雜質(zhì)，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。豆瓣醬樣品比較粘稠，在乙腈中不易分散，因此在樣品前處理時(shí)加入水，增加分散性，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

表2　不同前處理方法的加標(biāo)回收率

3.4方法加標(biāo)回收率

不同樣品的加標(biāo)回收率與回收率的變異系數(shù)見表3。豆瓣醬的加標(biāo)回收率在73%～106%之間，變異系數(shù)在9.2%～9.9%之間。辣椒醬的加標(biāo)回收率在76%～110%之間，回收率的變異系數(shù)在4.8%～14.1%之間。辣椒油的加標(biāo)回收率在74%～106%之間，回收率的變異系數(shù)在6.9%～8.2%之間。辣椒粉的添加回收率在73%～106%之間，回收率的變異系數(shù)在9.1%～11.3%之間。說明該方法檢測(cè)豆瓣醬等調(diào)味料的準(zhǔn)確性與重復(fù)性較好。

表3　樣品加標(biāo)回收率與變異系數(shù)

3.5方法批內(nèi)差與批間差

樣品分別使用3批試劑檢測(cè)，每批試劑檢測(cè)10次，批內(nèi)差與批間差見表4。由表可知，批內(nèi)差在8.4%～9.4%之間，小于10%，批間差10.5%，小于15%，說明該方法的批內(nèi)差異與批間差異較小。

表4　批內(nèi)差與批間差

3.6方法特異性

羅丹明B與蘇丹紅，酸性橙II，堿性橙2，堿性橙21，堿性橙22的交叉反應(yīng)見表5。由表可見，上述染料與羅丹明B均沒有交叉反應(yīng)，說明該方法檢測(cè)羅丹明B的特異性良好。

表5　羅丹明B與常見染料的交叉反應(yīng)

4　結(jié)束語

本研究通過優(yōu)化羅丹明B酶聯(lián)免疫分析試劑的反應(yīng)參數(shù)，包括抗原包被條件，抗體與酶標(biāo)二抗的工作濃度，建立了羅丹明B的酶聯(lián)免疫分析方法，檢測(cè)限為0.786ng/g，靈敏度較高。本研究通過優(yōu)化樣品前處理方法，建立了以水、乙腈、正己烷3種提取液為基礎(chǔ)的樣品前處理方法，檢測(cè)豆瓣醬等調(diào)味品中的羅丹明B，平均回收率在82%～104%之間，平均批內(nèi)差為9.0%，平均批間差為10.5%，準(zhǔn)確度較高。該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于羅丹明B的現(xiàn)場(chǎng)大量樣品快速檢測(cè)。

在上述研究成果的基礎(chǔ)上，可將研究化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)應(yīng)用于羅丹明B的檢測(cè)［12］，在基底上包被羅丹明B合成抗原，依次加入樣品，酶標(biāo)二抗，羅丹明B單克隆抗體，形成抗原-抗體-酶免疫復(fù)合物，洗滌后加入發(fā)光底物，酶催化底物發(fā)光，通過檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算樣品中羅丹明B的濃度，與現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析方法相比，該方法可以提高靈敏度，擴(kuò)展線性范圍。

也可應(yīng)用磁微粒偶聯(lián)免疫分析技術(shù)［13］，在磁微粒表面連接羅丹明B合成抗原，將磁微粒偶聯(lián)物，樣品，羅丹明B單克隆抗體，酶標(biāo)二抗混合，形成磁微粒-抗原-抗體-酶免疫復(fù)合物，磁分離后加入底物，酶催化底物顯色或發(fā)光，通過檢測(cè)信號(hào)計(jì)算樣品中羅丹明B的濃度，與現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫分析方法相比，該方法可以減少操作步驟，縮短檢測(cè)時(shí)間。

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（編輯：莫婕）

Establishment and application of enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）for Rhodamine B

WANG Lin，WANG Xue，TIAN Jingmiao
（Beijing Purkinje General Instrument Co.，Ltd.，Beijing 101200，China）

A fast assay method of enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）for Rhodamine B（RhB）is established.The method is characterized into that IC50 is 1.3 ng/mL and the limit of detection is 0.786 ng/g.For the detected bean sauce by the method，its average recovery rate is 83%at the fortified concentration of 5 ng/g and 89%at the fortified concentration of 10 ng/g.For the detected chili sauce，its average recovery rate is 88%at the fortified concentration of 5 ng/g and 104%at the fortified concentration of 10ng/g.For the detected chili oil，its average recovery rate is 94%at the fortified concentration of 5 ng/g and 101%at the fortified concentration of 10 ng/g.For the detected chili powder，its average recovery rate is 82%at the fortified concentration of 5ng/g and 90%at the fortified concentration of 10ng/g.The intra assay CV of the ELISA method is 9.0%，and the inter assay CV is 10.5%.The ELISA method has no cross reaction with other common dyes.The method is featured with simple and convenient operation and accurate result，and it is applicable to rapid detection of a great number of Rhodamine B samples on site.

enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）；Rhodamine B；bean sauce；chili sauce；chili oil；chili powder

A

1674-5124（2016）06-0060-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.06.014

2015-12-23；

2016-01-18

王琳（1980-），男，遼寧海城市人，工程師，碩士，研究方向?yàn)榭焖僭\斷檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用。