衛(wèi)艷萍，張如幸，史四季，劉秀琴，趙林棟

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miR-320及下游靶基因survivin在銀屑病皮損中的表達(dá)

衛(wèi)艷萍，張如幸，史四季，劉秀琴，趙林棟

衛(wèi)艷萍

目的 檢測尋常性銀屑病皮損中miR-320及其下游靶基因survivin mRNA的表達(dá)水平。方法 采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測40例尋常性銀屑病患者皮損及40名健康對照皮膚中miR-320、survivin mRNA的表達(dá)水平，運用雙熒光素酶報告實驗驗證survivin是miR-320的靶基因。miR-320和survivin表達(dá)水平兩組間比較采用t檢驗，尋常性銀屑病皮損中miR-320與survivin表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。結(jié)果 與健康對照皮膚相比，尋常性銀屑病皮損中miR-320表達(dá)量為對照組的（0.561±0.11）倍，表達(dá)明顯下調(diào)（t=3.06，P＜0.05）；survivin mRNA表達(dá)量為對照組的（2.034±0.26）倍，表達(dá)水平明顯上調(diào)（t=3.35，P＜0.05）；雙熒光素酶報告實驗結(jié)果提示survivin是miR-320的靶基因，尋常性銀屑病皮損中miR-320 與survivin mRNA呈負(fù)相關(guān)（r2=0.634，P＜0.05）。結(jié)論 miR-320可能通過調(diào)控其下游靶基因survivin的異常表達(dá)參與尋常性銀屑病皮損的形成過程。

銀屑??；miR-320；survivin

［J Pract Dermatol， 2016， 9（4）：225-228］

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病為多因素參與、多基因改變及多階段發(fā)展的病變過程。其主要組織病理改變?yōu)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞異常增生、角化不全和炎性細(xì)胞浸潤。銀屑病發(fā)病機制的研究一直是皮膚科研究的重點［1-4］。microRNA（miRNA）是一類長度為18～25 個核苷酸組成的小分子RNA，在調(diào)控基因表達(dá)中扮演著至關(guān)重要的角色，通過與靶基因作用，使其在轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程中被抑制或直接被降解，導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平降低，從而參與多種生物學(xué)過程［5］。其在個體生長發(fā)育、細(xì)胞增生凋亡、炎癥和腫瘤等多種生理病理過程中起著十分重要的作用，而其失衡表達(dá)亦可促進多種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展［6-10］。根據(jù)5'端序列不同，miRNA可分為多個家族，其中miR-320位于1p13.1，在上皮組織特異性表達(dá)，參與皮膚發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及功能維持，是皮膚中重要的調(diào)控因子。miR-320為survivin上游重要的調(diào)控基因。以往的研究證實，survivin 具有促進細(xì)胞增生和抑制細(xì)胞凋亡的作用， 凋亡抑制基因survivin在尋常性銀屑病皮損中高表達(dá)，且參與角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生等組織病理過程［11，12］，但其具體的調(diào)控機制不清。本研究旨在檢測尋常性銀屑病皮損組織中miR-320和survivin的表達(dá)情況，及miR-320低表達(dá)對其下游靶基因survivin表達(dá)的影響，探討尋常性銀屑病皮損中survivin基因表達(dá)上調(diào)的原因。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

實驗組標(biāo)本來源于2015年3―9月在我院皮膚科就診的40例尋常性銀屑病患者，皮損組織活檢后迅速凍存于液氮中；另選取40名健康人皮膚作為對照。兩組在年齡、性別、取材部位相匹配。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有銀屑病患者與健康對照者均簽署知情同意書。

1.2 材料與試劑

新鮮組織miRNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)公司），一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（美國羅氏公司），引物（上海吉瑪生物技術(shù)公司），DEPC及RNA～free水（北京索萊寶生物技術(shù)公司），Trizol、氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），293T細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫）培養(yǎng)于37℃條件下、5 %CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3 方法

1.3.1 總RNA和miRNA提取 常規(guī)Trizol試劑從銀屑病組織及其正常組織中抽提總RNA，DEPC水溶解沉淀，提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。試劑盒購自Invitrogen公司。應(yīng)用微量紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度。

1.3.2 RT-PCR檢 測miR-320、survivin mRNA的 表達(dá) 采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用20 μl反應(yīng)體系，具體參見試劑盒說明書，miRNA的反轉(zhuǎn)錄采用加尾。SYBR green I染料法進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，取1 μl上述cDNA為模板。miR-320引物Forward 5'TCCGAAGCGGGAGAGTTGGG3'，Reverse 5'GTGCAGGGTCCGAGGT3'，內(nèi)參照U6引物 Forward 5'TCCGATCGTGAAGCGTTC3'，Reverse 5'GTGCAGGGTCCGAGGT3'；Survivin引 物Forward 5'CACTGCC CCACTGAGAACGAG3'，Reverse 5'TT TCCTTTGCATGGGGTCGTC3'，內(nèi)參照GAPDH引物Forward 5'GCAAATTCCATGGCACCGTCA3'，Reverse 5'GACGTACTCAGCGCCAGCATC3'。每個檢測樣本做3個復(fù)孔，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱3 min；95℃12 s，60℃40 s，40個循環(huán)。miR-320和Survivin mRNA的表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示。

1.3.3 雙熒光素酶報告實驗 survivin基因片段通過PCR的方法獲得，基因片段上應(yīng)包含于miR-320特異性結(jié)合的區(qū)域，將survivin克隆入pmirGLO載體（購自Promega公司）中，將survivin的3'UTR進行基因測序，并命名為pmirGLO-wt- survivin，將與miR-320結(jié)合位點發(fā)生突變的survivin 的3'UTR命名為pmirGLO-mut- survivin。293T細(xì)胞接種于96孔板中，使用Lipofectamine? 2000 （購自Invitrogen公司）分別將野生型或突變型雙報告載體與miR-320 mimics 或Scramble共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細(xì)胞24 h，之后在雙報告檢測儀下檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采 用SPSSl7.0統(tǒng) 計 軟 件，miR-320、survivin mRNA的表達(dá)水平以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的差異比較采用t檢驗；應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，分析miR-320 表達(dá)與survivin miRNA表達(dá)之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病皮損中miR-320 mRNA表達(dá)

實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，尋常性銀屑病患者皮損中miR-320 mRNA表達(dá)量為健康對照的（0.56±0.11）倍；結(jié)果符合正態(tài)分布，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.06，P＜0.05）。結(jié)果表明，銀屑病皮損中miR-320表達(dá)水平較健康對照者皮膚組織明顯下調(diào)（圖l）。

2.2 survivin mRNA在尋常性銀屑病皮損中的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，尋常性銀屑病患者皮損中survivin mRNA表達(dá)量為健康對照的（2.03±0.26）倍，結(jié)果符合正態(tài)分布，經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.35，均P＜0.05）。結(jié)果表明，銀屑病皮損中survivin表達(dá)水平較健康對照者皮膚組織明顯上調(diào)（圖2）。

圖1 RT-PCR檢測尋常性銀屑病患者皮損與健康對照皮膚組織中miR-320的相對表達(dá)量

圖2 RT-PCR檢測尋常性銀屑病患者皮損與健康對照皮膚組織中survivin mRNA的相對表達(dá)量

2.3 survivin與miR-320的關(guān)系

通過生物信息學(xué)軟件分析，miRNA-320與survivin的3'UTR區(qū)具有特異結(jié)合的位點（圖3a）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miRNA-320 mimics和pmirGLO-wt- survivin細(xì)胞組的熒光素酶活性較其他3組明顯降低（P＜0.05）（圖3b）。結(jié)果表明，survivin是miR-320的靶基因，miR-320可以通過與survivin的3'UTR特異結(jié)合而抑制survivin基因的表達(dá)，對其發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

圖3 survivin是miR-320靶基因的驗證結(jié)果

2.4 尋常性銀屑病皮損中miR-320和survivin mRNA表達(dá)的相關(guān)性

將40例銀屑病患者皮損標(biāo)本檢測的miR-320和survivin mRNA表達(dá)水平進行回歸分析，結(jié)果顯示，二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，r2=0.634（圖4）。與雙熒光素酶報告實驗結(jié)果對比，進一步說明在尋常性銀屑病患者皮損中miR-320對survivin 表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。

圖4 尋常性銀屑病患者皮損中miR-320和survivin mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

銀屑病為一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其全球發(fā)病率為0.5%～4.6%。因其反復(fù)發(fā)作，難以治愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其確切病因尚未明確。目前發(fā)現(xiàn)多種miRNAs 分子在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增生、分化、皮膚炎癥及與免疫細(xì)胞之間的相互影響等方面起著重要作用［10］，可能與銀屑病的發(fā)病有一定關(guān)系。miRNA是內(nèi)源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA，主要功能為轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，參與基因表達(dá)的調(diào)控過程，從而在細(xì)胞分化、增生、凋亡、抗病毒及腫瘤免疫中發(fā)揮作用，miRNA對其靶基因的調(diào)節(jié)障礙會導(dǎo)致不同疾病的發(fā)生［4］。本研究結(jié)果顯示，銀屑病皮損中miR-320的表達(dá)水平較健康對照皮膚組織明顯下調(diào)，與楊志波等［1］采用基因芯片技術(shù)篩選銀屑病皮損組織和健康皮膚組織中差異性表達(dá)的miRNA結(jié)果一致。其他學(xué)者研究顯示，miRNA-34a 和miR-26b在銀屑病皮損組織存在異常表達(dá)，并且與銀屑病皮損的發(fā)生相關(guān)［13，14］。提示miRNA的表達(dá)異常應(yīng)該參與了銀屑病皮損的發(fā)生，可能是通過多個調(diào)控通路發(fā)揮作用的。

survivin基因主要在細(xì)胞周期G2/M期表達(dá)，定位于細(xì)胞有絲分裂的紡錘體，具有促進細(xì)胞有絲分裂的作用［13］。此外，survivin基因還可以直接抑制各種凋亡途徑的終末效應(yīng)蛋白Caspase-3和Caspase-7，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用［15，16］。本研究結(jié)果顯示，尋常性銀屑病皮損中survivin mRNA的表達(dá)水平較健康對照皮膚組織明顯上調(diào)，與國內(nèi)外的研究結(jié)果均一致［17-19］。而survivin基因的高表達(dá)與銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增生和分化有關(guān)，同時還參與了真皮乳頭層毛細(xì)血管的增生和擴張［20］。

miRNA通過作用于其靶基因mRNA的3'UTR區(qū)來發(fā)揮調(diào)控作用。為了驗證miR-320的靶基因，筆者應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進行分析，結(jié)果顯示miR-320 與survivin mRNA的3'UTR區(qū)存在特異性結(jié)合位點。雙報告結(jié)果顯示miR-320可顯著降低pmirGLO-wt-survivin的熒光素酶活性，而對pmirGLO-mutsurvivin無明顯影響，驗證了survivin是miR-320調(diào)控的一個直接靶基因。40例銀屑病患者皮損標(biāo)本中miR-320和survivin mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析結(jié)果顯示，二者表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。由此推測，miR-320的異常表達(dá)可能是導(dǎo)致survivin表達(dá)上調(diào)的原因，進而參與促進角質(zhì)形成細(xì)胞增生，抑制其凋亡，參與銀屑病皮損的形成過程。

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Expressions of miR-320 and its downstream target gene survivin in psoriatic lesions

WEI Yan-ping，ZHANG Ru-xing，SHI Si-ji，et al
Department of Dermatology， Jiaozuo People's Hospital， Jiaozuo 454002， China

Objective To measure the expressions of miR-320 and its downstream target gene survivin in psoriatic vulgaris lesions. Methods Tissue specimens were collected from lesions of 40 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 40 healthy human controls. Real-time PCR was performed to detect miR-320 and survivin mRNA expressions. Luciferase reporter assay was used to evaluate whether survivin is a direct target of miR-320. Statistical analysis was carried out by t-test for intergroup comparisons and by Pearson correlation analysis for the analysis of correlation between miR-320 and survivin expressions in psoriasis vulgaris lesions. Results Compared with the normal control skin， psoriasis vulgaris lesions showed significantly decreased mRNA expression level of miR-320 （0.561±0.1l， t=3.06， P＜0.05）， but increased mRNA expression level of survivin （2.034±0.26， t=3.35， P＜0.05）. The mRNA expression level of miR-320 showed a significantly negative correlation with that of survivin （r2=0.634， P＜0.05）. Luciferase reporter assay showed that survivin was a direct target of miR-320. Conclusion MiR-320 might participate in the development of psoriatic lesions via targeting the regulation of its downstream target survivin.

Psoriasis；MiR-320；Survivin

R758.63

A

1674-1293（2016）04-0225-04

2015-11-25

2016-01-19）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160401

454002焦作，焦作市人民醫(yī)院皮膚性病科（衛(wèi)艷萍，張如幸，史四季， 劉秀琴， 趙林棟）

衛(wèi)艷萍，主治醫(yī)師，研究方向：皮膚外科

E-mail： weiyanping1977716@126.com

趙林棟，E-mail： jz_zld@163.com