吳西軍 董智慧 舒莉萍 何志旭 ，3

（1貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心 貴州 貴陽 550004）

（2貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室 貴州 貴陽 550004）

（3貴州省兒童醫(yī)學(xué)中心 貴州 貴陽 550004）

人EC-SOD基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

吳西軍1，2董智慧1舒莉萍1，2何志旭1，3

（1貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心 貴州 貴陽 550004）

（2貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室 貴州 貴陽 550004）

（3貴州省兒童醫(yī)學(xué)中心 貴州 貴陽 550004）

目的：構(gòu)建攜帶EC-SOD基因和增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP)報告基因的真核表達(dá)載體，并觀察其在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（huMSCs）細(xì)胞中的表達(dá)。方法：從人外周血中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)率制備cDNA,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）中獲取EC-SOD基因，其與真核表達(dá)載體pCS2+經(jīng)ClaI/EcoRI雙酶切后；經(jīng)T4 DNA連接酶連接，獲得重組質(zhì)粒pCS2+-EC-SOD，用菌液PCR、ClaI/EcoRI雙酶切及測序鑒定正確后，將其與經(jīng)PCR獲取的EGFP基因用EcoRI/xbaI雙酶切；經(jīng)T4 DNA連接酶連接，獲得pCS2+-EC-SOD-EGFP重組質(zhì)粒，用菌落 PCR、EcoRI/xbaI雙酶切及測序鑒定。用納米試劑法轉(zhuǎn)染huMSCs細(xì)胞，用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)。結(jié)果：成功獲取了EC-SOD基因和EGFP基因，重組質(zhì)粒pCS2+-ECSOD-EGFP經(jīng)菌落PCR和雙酶切均得到大小一致的目的條帶，經(jīng)測序鑒定該序列與GenBank中人EC-SOD基因、EGFP基因序列的同源性達(dá)100%，基因插入方向正確；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染huMSCs細(xì)胞后可見EGFP增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)論：成功構(gòu)建了EC-SOD的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCS2+-EC-SOD-EGFP，且能在huMSCs細(xì)胞中表達(dá) 。

EC-SOD基因；增強(qiáng)綠色熒光蛋白；表達(dá)載體；轉(zhuǎn)染

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases，SOD)是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，其功能是清除細(xì)胞生命活動中產(chǎn)生的超氧離子。在哺乳動物SOD共有三種亞型：Mn-SOD存在于線粒體，Cu／Zn.SOD主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD，EC-SOD)是唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型，通過其肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heparin.binding domain，HBD)與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合，主要存在于是細(xì)胞外體液，如淋巴液、滑膜液及血漿中，擔(dān)負(fù)著這些部位艱巨的清除超氧化物的作用[1]，這些特性為其在健康領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。本研究通過構(gòu)建重組的真核表達(dá)質(zhì)粒pCS2+-EC-SOD-EGFP，并且在并將其在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究干細(xì)胞聯(lián)合EC-SOD在抗衰老中的作用奠定基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、pCS2+載體質(zhì)粒、E.coliDH50α由貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫保存，PCR引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試 劑First.strand plus購自Invitrogen公司，高保真KOD—Plus FCR酶購自TOYOBO公司，限制性內(nèi)切酶Cal1、EecR I和Xba I、T4 DNA連接酶以及均購自Fermentas公司，質(zhì)粒小抽 試劑盒購自于Axygen公司。DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生物公司，基因鑒定測序由北京諾賽基因公司完成。DMEM培養(yǎng)液、0.25% 胰蛋白酶購自美國Hyclohe公司，胎牛血清購自杭州四季青生物制品有限公司，納米轉(zhuǎn)染試劑由xxx公司惠贈，外周血來源于本人捐獻(xiàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）總RNA的提取及目的基因的獲取 抽取外周血勻漿，參照Trizol Total RNA說明書，采用一步法提取人外周血總RNA后再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。在NCBI pubmed的Genebank數(shù)據(jù)庫中查找到目的基因EC-SOD（登錄號為：NM-003102.2）以及EGFP（登錄號：NC-013179.1）編碼序列的ORF，參照pCS2+質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，用NCBI ORF及DNAMAN軟件各自對其進(jìn)行ORF分析，限制性酶切分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑儆肞rimer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計不含EC-SOD終止子及EGFP啟動子的特異性引物：

表1 ec-sod、egfp基因引物

擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30S；55/62℃退火30S，68℃延伸1min，共30次循環(huán)，最后延伸68℃10min，PCR產(chǎn)物大小為720/717bp，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

（2） pCS2+-EC-SOD-EGFP表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

EC-SOD基因PCR產(chǎn)物和pCS2+載體分別用限制性內(nèi)切酶Cal I和EcoR1進(jìn)行雙酶切酶切并割膠回收。通過T4連接酶將EC-SOD和pCS2+載體重組連接，轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌，經(jīng)篩選后挑取單克隆，搖菌，質(zhì)粒小提試劑盒抽取質(zhì)粒DNA。用限制性內(nèi)切酶Cal I和EcoR1進(jìn)行雙酶切和菌液PCR驗(yàn)證，正確后送往京賽諾公司進(jìn)行序列測定并進(jìn)行Blast比對。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒EC-SOD-pCS2+和EGFP基因片段用限制性內(nèi)切酶EcoR1和Xba I進(jìn)行雙酶切并割膠回收。通過T4連接后轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌，經(jīng)篩選后挑取單克隆，搖菌并質(zhì)粒小提試劑盒抽取質(zhì)粒DNA。用限制性內(nèi)切酶Cal I和EcoR1進(jìn)行雙酶切和菌液PCR驗(yàn)證，正確后送往京賽諾公司進(jìn)行序列測定并進(jìn)行Blast比對。

（3）人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及重組質(zhì)粒pCS2+-EC-SOD-EGFP轉(zhuǎn)染 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇后加入含10%FBS的低糖DMEM，將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（CO2濃度為5%，溫度為37℃），傳代后待細(xì)胞長至70%左右時，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒EC-SOD-EGFP-pCS2+與轉(zhuǎn)染試劑直接混合，震蕩混勻制備核酸-納米混合物，將核酸-納米混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕柔混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，24小時換液，48小時后熒光顯微鏡下觀察EC-SOD-EGFP融合蛋白的表達(dá)情況。

2.結(jié)果

2.1 EC-SOD-pCS2+重組質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）外周血總RNA提取 從人外周血中提取出EC-SOD總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳檢測，兩個樣本條帶清晰，均可見28s、18s、5s條帶(如圖1)。

圖1 人外周血總RNA電泳圖

（2） EC-SOD目的基因RT-PCR擴(kuò)增 以cDNA為模版，用設(shè)計合成的引物SOD3的上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳結(jié)果顯示，三個樣本在與700bp大致平行處均有明亮的條帶，與預(yù)期條帶大小一致(如圖2)。

圖2 EC-SOD基因PCR擴(kuò)增電泳圖(1、DNA markerⅤ；2、EC-SOD PCR產(chǎn)物）

（3）SOD3-pCS2+重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 將SOD3-pCS2+質(zhì)粒以EcoRI及ClaI雙酶切，EcoRI單酶切，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果顯示，在4000bp附近有兩條帶，700bp附近有一條帶，條帶大小與目標(biāo)條帶大小相符，可初步鑒定有目的基因插入pCS2+質(zhì)粒DNA。

圖3 pCS2+-EC-SOD重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖（M、DNA makerⅣ；1、pCS2+-EC-SOD重組質(zhì)粒ClaI 和 EcoRI 雙酶切；2、pCS2+-EC-SOD重組質(zhì)粒 EcoRI 單酶切）

（4）SOD3-pCS2+重組質(zhì)粒菌落PCR結(jié)果 挑取陽性克隆菌落培養(yǎng)，取4個質(zhì)粒DNA菌液裂解，以其為模版，進(jìn)行菌落PCR檢測，根據(jù)電泳結(jié)果，在700bp上方有明顯條帶，與目的基大小相符，說明這單克隆菌落中有目的基因存在(如圖4)。

圖4 EC-SOD基因菌落PCR結(jié)果電泳圖。(1、DNA markerⅤ；2、EC-SOD PCR產(chǎn)物；3、空白對照）

（5）測序結(jié)果 將重組質(zhì)粒pCS2+-EC-SOD委托北京諾賽生物公司進(jìn)行測序，其結(jié)果經(jīng)Genebank中EC-SOD進(jìn)行序列比對，與r人EC-SOD基因序列完全一致，ATG起始可見，酶切位點(diǎn)存在（如圖5）。

圖5 EC-SOD測序結(jié)果圖（部分）

2.2 pCS2+-EC-SOD-EGFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）EGFP基因PCR結(jié)果 以中心保存的含有EGFP整個編碼序列的質(zhì)粒為模版，PCR擴(kuò)增后獲得不含ATG起始的EGFP序列的PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳結(jié)果可見，在位于700bp附近可見一明顯條帶，與預(yù)期733bp大小相符（如圖6）。

圖6 EGFP基因PCR結(jié)果（1、DNA markerⅤ；2、EGFP PCR產(chǎn)物；3、空白對照）

（2）pCS2+EC-SOD-EGFP重組質(zhì)粒酶切鑒定 將SOD3-egfp-pCS2+重組質(zhì)粒以EorRI 及XbaI 雙酶切，XbaI單酶切鑒定，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在5500bp附近有兩條帶，700bp附近可見一條明顯的條帶，大小與預(yù)期的相符，初步判斷egfp已經(jīng)插入（如圖7）

圖7 EC-SOD-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒酶切結(jié)果電泳圖（M、DNA makerⅣ；1、pCS2+-EC-SOD重組質(zhì)粒ClaI 和 EcoRI 雙酶切；2、pCS2+-EC-SOD重組質(zhì)粒 EcoRI 單酶切）

（3）SOD3-egfp-pCS2+重組質(zhì)粒菌落PCR 挑取SOD3-egfp-pCS2+重組質(zhì)粒陽性克隆菌落培養(yǎng)，取6個質(zhì)粒DNA菌液裂解，以其為模版，1個空白對照，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果顯示，2號質(zhì)粒濃度較低，3-7號泳道在700bp上方有明顯條帶，與目的基因大?。?23bp）相符，說明幾個菌落中皆有目的基因存在(如圖8)。

圖8 EGFP基因菌落PCR結(jié)果電泳圖（1、DNA Marker Ⅴ；2、EGFP PCR產(chǎn)物；3、空白）

（4）EGFP測序結(jié)果 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒委托北京諾賽生物公司進(jìn)行測序，其結(jié)果經(jīng)Genebank中EGFP進(jìn)行序列比對，與基因序列完全一致，酶切位點(diǎn)存在（如圖9）。

圖9 EGFP基因序列測定結(jié)果圖（部分）

2.3 pCS2+-EC-SOD-EGFP重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第五代培養(yǎng)板中細(xì)胞達(dá)70%左右時，加入制備好的轉(zhuǎn)染混懸液，48小時后熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖10：

圖10 pCS2+-EC-SOD-EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染huMSCs 48小時后熒光顯微鏡下觀察（A1、B1為明場；A2、B2為熒光場；x100）

3.討論

外源蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)受多種因素影響，比如：啟動子的強(qiáng)度、整合位置、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性、mRNA的翻譯效率、目的蛋白的穩(wěn)定性、目的蛋白的折疊效率等其中重要因素均與表達(dá)載體的選擇有關(guān)[2]。所以表達(dá)載體的選擇是決定外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵，而啟動子的強(qiáng)度對于基因的表達(dá)尤其重要。本課題所選用的pCS2+載體，含有較強(qiáng)的啟動子，符合特定表達(dá)載體要求。EC-SOD基因和EGFP基因融合蛋白表達(dá)，要求我們在設(shè)計特異性引物時要注意EC-SOD基因的終止子和EGFP基因啟動子的特殊處理?？寺』颍迦胼d體，雙酶切及菌落PCR鑒定，序列測定并進(jìn)行blast比對，找出引入的酶切位點(diǎn)，比對完全正確后在進(jìn)行下步操作，保證所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒能夠保真，并利用納米轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。

人的EC-SOD的基因位位于人染色體的4q21與牛及大鼠的EC-SOD基因和Cu/Zn-SOD的基因有60%的同源性。人EC-SOD的cDNA編碼30kD大小的亞基，是由240個氨基酸殘基組成的多肽，其中包含18個氨基酸組成的信號肽，因此成熟蛋白由222個氨基酸組成[1、3]。EC-SOD是一種輕微疏水的糖蛋白，主要存在于細(xì)胞外液和結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)中。當(dāng)機(jī)體受到射線照射、代謝物物聚集后會產(chǎn)生大量氧自由基及中間產(chǎn)物等活性氧(reactive oxygen species，ROS)，其可以誘導(dǎo)產(chǎn)生促有絲分裂效應(yīng)并參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)[4-5]，但當(dāng)ROS不斷增多，無法清除時，會損傷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類、核及線粒體的DNA。使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的核酸鏈斷裂，導(dǎo)致腫瘤、炎癥、衰老、血液病及心、肝、肺、皮膚等部位產(chǎn)生病變[6-8]。SOD能夠有效清除氧自由基，從而起到保護(hù)機(jī)體細(xì)胞的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞是起源于中胚層的一類多能細(xì)胞，它具有以下特性自我更新，多向分化能力及較低的免疫原性讓其有較廣泛的應(yīng)用前景。不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有非常相似生物學(xué)特性[9-12]，正常生理情況下斷分化為新的間質(zhì)細(xì)胞補(bǔ)充、替代老化的間質(zhì)細(xì)胞和組織。所以補(bǔ)充外源性間充質(zhì)干細(xì)胞是否能改善，甚至逆轉(zhuǎn)組織器官的衰老是一個很值得探究的研究熱點(diǎn)。將EC-SOD與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合抗衰老，既能清楚氧自由基代謝壓力和輻射老化，又能通過干細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)組織再生、調(diào)節(jié)免疫功能，兼顧內(nèi)外因素抗衰老[13-17]，極具應(yīng)用前景。

本項研究成功的構(gòu)建了pCS2+-EC-SOD-EGFP重組真核表達(dá)質(zhì)粒載體，經(jīng)去內(nèi)毒素處理后通過納米試劑制備混懸液后轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)然后48小時在熒光顯微鏡下可見有綠色熒光蛋白的表達(dá)，由于構(gòu)建的pCS2+-EC-SOD-EGFP重組真核表達(dá)質(zhì)粒載體表達(dá)的是融合蛋白，必須在EC-SOD表達(dá)的情況下才可以繼續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白，可見重組表達(dá)構(gòu)建和轉(zhuǎn)染是成功的。為進(jìn)一步進(jìn)行EC-SOD與間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合抗衰老研究打下堅實(shí)基礎(chǔ)。

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1009-5624（2016）05-0074-05