沈佳偉　曹秀琴

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院閔行分院，上海　200241

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在體單向腸灌流模型研究三七人參皂苷Rb3大鼠腸吸收特性

沈佳偉曹秀琴*

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院閔行分院，上海200241

目的：研究人參皂苷Rb3在大鼠腸道的吸收動(dòng)力學(xué)，并考察不同的藥物濃度和常用的吸收促進(jìn)劑對(duì)其吸收速率的影響。方法：進(jìn)行大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)，研究人參皂苷Rb3在腸道不同腸段的吸收情況。結(jié)果：人參皂苷Rb3在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收速率為十二指腸 > 空腸 ≈ 回腸 > 結(jié)腸，人參皂苷Rb3在低、中、高3個(gè)濃度下的吸收速率分別為低濃度 > 中濃度 ≈ 高濃度。結(jié)論：小腸整個(gè)腸段是人參皂苷Rb3的主要吸收部位，十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸都有不同程度的吸收，其中十二指腸段吸收速率最快。人參皂苷Rb3在小腸中吸收速率隨著濃度的增加而逐漸減小，推測(cè)被動(dòng)擴(kuò)散、易化擴(kuò)散和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為影響人參皂苷Rb3吸收的主要轉(zhuǎn)適機(jī)制。

人參皂苷Rb3；在體腸吸收；吸收速率常數(shù)

三七又名田七，為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根，主要分布于云南、廣西等省份，是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材[1]。三七具有散瘀止血、消腫定痛之功效，提高機(jī)體免疫力等多種藥理活性[2]，其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是三萜皂苷類成分，此外還含有一些氨基酸、多糖類等成分。三七的主要藥用部位是其根和根莖?，F(xiàn)在隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在三七葉中也存在著許多種皂苷成分，其中以人參皂苷Rb3、Fc和Rb1含量較高，具有鎮(zhèn)靜安神、清熱消腫、活血止血之功效，能用于治療神經(jīng)衰弱，失眠，抑郁等疾病[3]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)大鼠腸道的生理狀況與人相似這一特點(diǎn)，采用大鼠在體腸吸收模型，研究Rb3在大鼠腸道的吸收動(dòng)力學(xué)特征，并考察吸收促進(jìn)劑對(duì)吸收速率的影響，為三七口服給藥制劑的研制提供生物藥劑學(xué)依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重( 230±20)g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證：scxk(瀘)2008-2016]。

1.2儀器HL-2型恒流泵(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；FA-2004型電子天平(上海精密儀器廠)；Agilent1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Thermo Syncronis C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，0.45μm微孔濾膜。

1.3藥品及試劑人參皂苷Rb3對(duì)照品(批號(hào)：201012，純度大于98%，結(jié)構(gòu)式如圖1)，氯化鈣、葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化鎂(購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，戊巴比妥鈉(上海行知化工廠)，Krebs-Ringer’s營(yíng)養(yǎng)液(pH=7.4)，乙腈(Fisher),其他試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1HPLC分析方法

2.1.1色譜條件的建立Thermo Syncronis C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水(60∶40)，流速為1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，進(jìn)樣量10μL。

2.1.2空白Kreb-Ringer’s 緩沖液的配置[4](下文簡(jiǎn)稱K試液)精密稱取氯化鈣0.37g、葡萄糖1.4g，分別加入少量蒸餾水溶解；稱取氯化鈉7.8g、氯化鉀0.35g、碳酸氫鈉1.37g、磷酸二氫鈉0.32g，氯化鎂0.02g，加蒸餾水溶解后與溶解的氯化鈉及葡糖糖液混勻，蒸餾水定容至1L，1mol·L-1鹽酸調(diào)pH至7.4即得，備用。

2.1.3空白干擾試驗(yàn)用空白K試液按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行大鼠不同腸段單向灌流，收集流出液，即得空白腸灌流液，采用9倍甲醇稀釋上述空白腸灌流液，過0.45 μm微孔濾膜，取濾液按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，考察空白腸灌流液對(duì)人參皂苷Rb3的測(cè)定是否有干擾。2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取人參皂苷Rb3對(duì)照品5mg，置10mL量瓶中，用K試液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得500mg·L-1的儲(chǔ)備液。用K試液為溶劑，逐步稀釋配制質(zhì)量濃度分別為250.0、100.0、50.0、20.0、10.0、5.0mg·L-1的人參皂苷Rb3溶液，照2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C，mg·L-1)進(jìn)行線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為C=5.6933×A+0.9093，R2=0.9996，人參皂苷Rb3在5～500mg·L-1線性良好，符合定量分析要求。

2.1.5精密度和回收率試驗(yàn)精密稱取適量藥物，用K試液配制20.0、50.0、100.0mg·L-1低、中、高3種質(zhì)量濃度的人參皂苷Rb3溶液，照2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以上述低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度做日內(nèi)和日間變異(n=6)，結(jié)果見表1，表明低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)和日間RSD均<2.0%。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的相對(duì)回收率見表2，分別為(99.18±0.99)%、(98.96±0.83)%、(95.97±1.91)%。

表1　精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2　回收率測(cè)定結(jié)果

2.2人參皂苷Rb3溶液的配置用少量生理鹽水溶解人參皂苷Rb3，用一定量的K試液(pH=7.4)稀釋定容即得。

2.3人參皂苷Rb3在灌流液中穩(wěn)定性研究取K試液對(duì)大鼠小腸段灌流，收集流出液，為空白腸液。用此液配制60mg·L-1的人參皂苷Rb3溶液3份，置37℃水浴恒溫。分別于0、1、2、3、4、5、6 h各取1mL置1.5mL離心管中，過0.45μm微孔濾膜，取濾液按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積響應(yīng)值，根據(jù)峰面積的變化研究人參皂苷Rb3在灌流液中穩(wěn)定性。

2.4恒流泵管道對(duì)人參皂苷Rb3的物理吸附情況考察根據(jù)2.3項(xiàng)方法，配制人參皂苷Rb3濃度為60mg·L-1的灌流液3份，用恒流泵將此灌流液以0.2mL·min-1的速度泵入硅膠管道內(nèi)，體外空循環(huán)2 h，分別于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 h收集流出的灌流液1mL，置1.5mL離心管中，過0.45μm微孔濾膜，取濾液按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積響應(yīng)值，計(jì)算灌流液中人參皂苷Rb3濃度。

2.5單向腸灌流將Wistar大鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，每組5只。取Wistar大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水，稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(劑量40mg·kg-1)，麻醉并固定。沿大鼠的腹中線打開約3cm，在待考察的大鼠小腸部分的兩端插管(十二指腸是從幽門以下2cm處開始約10cm長(zhǎng)的腸段，回腸是從盲腸上10～20cm處開始的腸段，空腸是十二指腸和回腸之間的腸段[5])，用線扎緊，與恒流泵連成回路。用預(yù)熱至37℃的生理鹽水輕緩地將腸內(nèi)容物沖洗干凈，再用空氣將生理鹽水排凈，然后先用空白K試液以2mL/min的流速循環(huán)15min，排除腸內(nèi)氣泡，再取含一定濃度人參皂苷Rb3的K試液(預(yù)熱至37℃)以2 mL/min的流速平衡30min，再以0.2mL/min的流速循環(huán)，調(diào)節(jié)流速時(shí)即為0時(shí)，以后分別于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 h取樣3.0mL，所收集的循環(huán)液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，高速離心(10000 r·min-1)10min，取上清液。按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。最后將大鼠處死，剪下被灌流腸段，準(zhǔn)確測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑[6]。根據(jù)恒流泵管道對(duì)人參皂苷Rb3的物理吸附情況考察結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)中所使用的硅膠管道用供試液飽和1h，為排除實(shí)驗(yàn)過程中所使用的硅膠管道對(duì)人參皂苷Rb3可能存在的物理吸附作用。 2.6灌流液體積的校正及數(shù)據(jù)處理在研究藥物的腸吸收機(jī)制時(shí)，由于小腸不僅吸收藥物也吸收水分，因此會(huì)使得灌流液體產(chǎn)生積變化。目前，國(guó)內(nèi)常用的校正水分的方法主要有重量法和酚紅法。本實(shí)驗(yàn)采用何承華等[7]使用的重量法，精密量取供試液1.00mL放入已稱重的玻璃瓶中，稱量液體的質(zhì)量，算出其密度ρin。從接收液樣品中精密量取1.00mL，放入已經(jīng)稱重玻璃瓶中，稱量液體的質(zhì)量，計(jì)算出流出液的平均密度ρout。Min和Mout分別為一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)出腸道灌流液的質(zhì)量，則Vin=Min/ρin,Vout= Mout/ρout。按下式[5]計(jì)算藥物吸收速率常數(shù)(Ka)以和藥物表觀滲透系數(shù)(Papp)。

Ka=(1-Cout/Cin×Vout/Vin)×Qin/πr2L

Papp=-QinLn(Cout/Cin×Vout/Vin)/2πrL

式中Vin和Vout分別為灌入和收集的供試液體積(mL)；Cin和Cout分別為進(jìn)口和出口處緩沖液中的藥物質(zhì)量濃度(g·L-1)；L和r分別為被考察腸段長(zhǎng)度(cm)和半徑(cm)；Qin為灌流速度(0.2mL·min-1)；Ka和Papp為6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0.25～2h)樣品的平均值。腸吸收數(shù)據(jù)處理后用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0進(jìn)行方差分析。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1空白干擾實(shí)驗(yàn)通過比較空白腸灌流液，含人參皂苷Rb3的腸灌流液和人參皂苷Rb3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖，結(jié)果表明，在上述色譜條件下，樣品與人參皂苷Rb3對(duì)照品在相應(yīng)位置有相似的吸收峰，而空白對(duì)照在藥物出峰處基線平穩(wěn)，對(duì)藥物測(cè)定無任何干擾(圖2)。

3.2人參皂苷Rb3在灌流液中穩(wěn)定性3份溶液中人參皂苷Rb3的峰面積在6h內(nèi)RSD分別為1.6%、1.3%、1.7%，表明6 h內(nèi)在37 ℃的供試液中人參皂苷Rb3穩(wěn)定性良好。

3.3恒流泵管道對(duì)人參皂苷Rb3吸附情況恒流泵的管道是硅膠管道，有一定物理吸附作用。根據(jù)恒流泵管道對(duì)人參皂苷Rb3的物理吸附情況考察結(jié)果，各時(shí)間點(diǎn)人參皂苷Rb3的峰面積RSD均<2.0%。通過計(jì)算人參皂苷Rb3濃度，發(fā)現(xiàn)前0.75h收集到的灌流液，測(cè)得藥物濃度略低于所配溶液的濃度，而在后0.45h收集的灌流液，所測(cè)得藥物濃度逐漸達(dá)到平衡，計(jì)算出的平衡濃度為配制的溶液濃度的(99.5±0.8)%。說明硅膠管道對(duì)人參皂苷Rb3有一定的物理吸附作用，且在0.75h時(shí)硅膠管道對(duì)人參皂苷Rb3的吸附作用可能達(dá)到飽和。3.4人參皂苷Rb3腸吸收用K試液分別配制高、中、低(分別為90、60、30 mg·L-1)3種不同質(zhì)量濃度的人參皂苷Rb3溶液，按照2.5項(xiàng)下的方法對(duì)4個(gè)小腸分段灌流，研究在不同小腸分段吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，表明人參皂苷Rb3可在全腸道被吸收，但在十二指腸的吸收速率最高，而在結(jié)腸中的吸收速率最低，其中在不同腸段中的吸收速率常數(shù)Ka大小順序是十二指腸>空腸≈回腸>結(jié)腸，表觀滲透系數(shù)Papp大小順序是十二指腸>空腸>回腸≈結(jié)腸。對(duì)各腸段參數(shù)進(jìn)行方差分析，十二指腸的吸收速率和滲透性顯著高于其他3個(gè)腸道(P<0.05)，回腸、結(jié)腸之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在30～90mg·L-1，在不同濃度時(shí), 吸收速率常數(shù)也有顯著性差異。對(duì)不同濃度下的吸收速率常數(shù)進(jìn)行單側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果：低濃度>中濃度≈高濃度(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)證明, 藥物濃度對(duì)Rb3在全腸道的吸收速率是有一定的影響的，說明Rb3大鼠腸道吸收存在飽和現(xiàn)象，提示其在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不僅僅是簡(jiǎn)單的被動(dòng)擴(kuò)散過程，可能還有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)或促進(jìn)擴(kuò)散也參與其中。

表3　不同濃度人參皂苷Rb3在不同腸段的吸收參數(shù)　±s，n=5)

4　討論

研究藥物在腸道吸收的方法很多，在體法能較真實(shí)地反映腸道的生理環(huán)境，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，技術(shù)成熟可靠。對(duì)藥物的小腸吸收研究常常采用在體腸循環(huán)灌流法及單向灌流法[8]。本研究采用大鼠在體單向腸灌流法，其實(shí)驗(yàn)條件與口服給藥后藥物接觸的腸道正常生理環(huán)境較接近。由于動(dòng)物個(gè)體間的差異性，在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)對(duì)受試動(dòng)物的數(shù)目有要求，即必須具有一定數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以保證足夠小的變異。本實(shí)驗(yàn)每個(gè)腸段都采用了5只大鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，保證了數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠[9]。

在體單向腸灌流法對(duì)要考察的某一腸段，以較低的灌流速度(0.2～0.3mL·min-1)進(jìn)行單向灌流，其吸收速率穩(wěn)定[10]，本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠腸灌流速度為0.2mL·min-1。

單向灌流模型中，腸道對(duì)水分的吸收往往會(huì)導(dǎo)致灌流液體積隨時(shí)間的變化而改變，有報(bào)道[11]采用吸收差的物質(zhì)如酚紅作為灌流液體積標(biāo)記的標(biāo)示物。但是長(zhǎng)時(shí)間灌流酚紅也存在一定程度的吸收，且酚紅可能干擾某些化合物的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)和分析測(cè)定，14C標(biāo)記的PEG存在放射性和安全性問題[12]，檢測(cè)方法的復(fù)雜性限制了其在普通實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。Sutton等[13-14]采用單向灌流模型，對(duì)重量法、酚紅法和14C-PEG-3350法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明重量法能顯著減少實(shí)驗(yàn)誤差，可作為大鼠單向灌流實(shí)驗(yàn)在體腸循環(huán)吸收實(shí)驗(yàn)中矯正灌流液體積的有效方法。故本實(shí)驗(yàn)采用具有較高準(zhǔn)確度的重量法來標(biāo)定灌流液體積的變化。

藥物分子的物理性質(zhì)對(duì)其體內(nèi)過程的行為起著重要作用[7]，藥物分子結(jié)構(gòu)與其物理性質(zhì)與其體內(nèi)生物利用度之間有一個(gè)“五規(guī)則”的聯(lián)系[15]，即大多數(shù)藥物分子的lgP≤5，相對(duì)分子質(zhì)量≤500，氫鍵受體(氧原子和氮原子總數(shù))≤10，氫鍵供體≤5，如果違背了1條以上規(guī)則，則該藥物分子存在體內(nèi)生物利用度問題。人參皂苷Rb3相對(duì)分子質(zhì)量為1078，違背“五規(guī)則”，理論推測(cè)人參皂苷Rb3生物利用度較低，此結(jié)論也與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的藥動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(0.54%)一致。

綜上研究人參皂苷Rb3為低滲透性，高溶解度的藥物，即吸收的限速過程是藥物的滲透過程，在制備其口服制劑時(shí)可采用改善藥物脂溶性的方法以提高其生物利用度，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)人參皂苷Rb3的口服劑型的設(shè)計(jì)具有一定的指導(dǎo)意義。由于本實(shí)驗(yàn)在藥物灌流之前先用生理鹽水沖洗了腸道使得多數(shù)菌群可能在循環(huán)前已隨腸內(nèi)容物一起被清除，因此小腸菌群代謝對(duì)人參皂苷Rb3腸吸收的影響情況還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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(編輯：梁志慶)

Studies on absorption of Ginsenoside Rb3 in Rat Intestine by in situ single pass intestine perfusion model

SHEN JiaweiCAO Xiuqin*

Minhang branch, Shanghai university of traditional Chinese medicine affiliated yueyang hospital, Shanghai 200241,China

Objective To investigate the absorption kinetics of ginsenoside Rb3 at different intestinal segments of rats and the influence of concentration on the absorptive kinetics. Methods An in situ intestinal perfusion model was applied to investigate systemically the absorptive kinetics of ginsenoside Rb3.Results The absorptive rate constants (Ka) of ginsenoside Rb3 at different intestinal segments was duodenum > jejunum ≈ ileum > colon. The Ka of ginsenoside Rb3 at the concentrations of low, medium, high levels was low > medium ≈ high level.Concluslon Ginsenoside Rb3 was well absorbed at the whole segment of intestine in rats, among which duodenum was the fastest. The absorption rate decreased with the increasing concentration of ginsenoside Rb3, implied that the absorption mechanism was mainly the passive diffusion, facilitated diffusion and active transport mechanism.

Ginsenoside Rb3; In Situ Intestinal Absorptive Model;Absorptive Promoter

2016-06-24

沈佳偉(1986-)，男，漢族，在讀碩士，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分分析。E-mail：redfenix@126.com

曹秀琴(1972-)，女，漢族，本科，副主任藥師，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：caoxqin@163.com

R965.1

A

1007-8517(2016)17-0037-05