潘妍 賈紅亮 汪長(zhǎng)鋼 李凌燕

摘要[目的]建立高效液相色譜法測(cè)定大豆及3種豆制品中大豆異黃酮組分和含量的方法，研究其大豆異黃酮組分的差異。[方法]將供試樣品用80%甲醇溶解提取，凈化后用WondaSil C18 WR（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱分離，以乙腈和磷酸水溶液（pH 3.0）作為流動(dòng)相，流速1 mL/ min，柱溫為40 ℃，用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)260 nm檢測(cè)大豆異黃酮組分，用外標(biāo)法進(jìn)行定量。[結(jié)果]大豆及3種豆制品中大豆異黃酮的含量，大豆最高，其次是豆芽、豆腐、豆?jié){。供試樣品的大豆異黃酮組分中大豆苷相關(guān)系數(shù)為0.997 2，黃豆黃苷相關(guān)系數(shù)為0.999 6，大豆苷元相關(guān)系數(shù)為0.994 7，黃豆黃素相關(guān)系數(shù)為0.999 1，染料木素相關(guān)系數(shù)為0.994 2，平行測(cè)定結(jié)果之差均低于算術(shù)平均值的10%。[結(jié)論]高效液相色譜法可用于豆制品中大豆異黃酮組分和含量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜；大豆異黃酮；豆制品

中圖分類號(hào) S4133 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）09-119-03

Abstract[Objective]A HPLC method for determining the components and content of soybean isoflavone in four soybean products was established.[Method]Samples were extracted with 80% methanol.The HPLC separation was performed on a WondaSil C18 WR（4.6×250 mm， 5 μm） by isocratic elution with acetonitrile and phosphoric acid water solution （pH 3.0） as mobile phase， flow rate 1 mL/ min， column temperature 40 ℃， and 260 nm was detected by diode array detector.[Result]The order of soybean isoflavone content was soybean>bean sprouts>tofu and soy milk.The correlation coefficients of the Daidzin， Glycitin， Daidzein， Glycitin， Genistein were 0.997 2， 0.999 6， 0.994 7， 0.999 1， 0.994 2， respectively.The difference of the parallel test results was lower than that of the arithmetic mean as 10%.[Conclusion]The HPLC method can be used for the detection of soybean isoflavone components and contents in soybean products.

Key words HPLC； Soybean isoflavone； Soybean products

大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是黃酮類化合物，因其結(jié)構(gòu)與雌激素相似，又稱植物雌激素。大豆中大豆異黃酮97%以上以糖苷形式存在，苷元僅占總量的2%～3%，其中組成成分有：染料木苷、大豆苷、大豆苷元、 黃豆黃素、染料木素、黃豆黃苷[1-3]。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)大豆異黃酮的方法主要有紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法等，其中高效液相色譜法具有樣品處理簡(jiǎn)單、操作容易、分離度好、定量準(zhǔn)確、可進(jìn)行組分檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。筆者建立了高效液相色譜法測(cè)定大豆及3種豆制品中大豆異黃酮組分和含量的方法，并研究了其大豆異黃酮組分的差異。

1 材料與方法

1.1 材料 大豆，市購(gòu)；豆腐，市購(gòu)；豆芽，自制；豆?jié){（料液比120∶1 g/L），豆?jié){機(jī)打漿。主要試劑：大豆苷、黃豆黃苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素中藥對(duì)照樣品，成都曼思特生物科技有限公司；石油醚、甲醇、乙醇，均為分析純；其他為常規(guī)試劑。

主要儀器：小熊DYJS6365豆芽機(jī)，廣東小熊電器有限公司；DJ12BA10豆?jié){機(jī)， 九陽(yáng)股份有限公司；高效液相色譜儀（LC20A）配二極管陣列檢測(cè)器（SPDM20A），日本島津。

1.2 方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備。

選取同批市購(gòu)大豆，加入2倍豆重水量，25 ℃下浸泡8 h后，放入豆芽機(jī)，選取發(fā)芽3 d的豆芽作為研究對(duì)象。稱取同批市購(gòu)大豆100 g，加入1 L純凈水，用豆?jié){機(jī)打漿，豆?jié){作為研究對(duì)象。

1.2.2 大豆、豆芽樣品預(yù)處理。

大豆用粉碎機(jī)粉碎，豆芽用打漿機(jī)打碎，用沸點(diǎn)為 30～60 ℃的石油醚，經(jīng)索氏抽提裝置抽提 24 h除油，將除油后的豆粕放在通風(fēng)櫥中過(guò)夜，將殘留的石油醚揮發(fā)干后，進(jìn)行再次粉碎，并過(guò)80目篩。準(zhǔn)確稱取豆粕0.5 g，加入80%甲醇 50 mL，超聲波振蕩儀振蕩20 min，9 000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.45 μm膜待測(cè)。

1.2.3 豆?jié){樣品預(yù)處理。

準(zhǔn)確量取5 mL豆?jié){于50 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液至接近刻度。超聲波振蕩儀振蕩20 min，9 000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.45 μm膜待測(cè)。

1.2.4 豆腐樣品預(yù)處理。

準(zhǔn)確稱取0.5 g豆腐于研缽中，加入80%甲醇溶液研磨，并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液至接近刻度。超聲波振蕩儀振蕩20 min，9 000 r/min離心5 min，取上清液，過(guò)0.45 μm膜待測(cè)。

1.2.5 高效液相色譜法檢測(cè)大豆異黃酮含量。

色譜柱：WondaSil C18 WR（5 μm）；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（SPDM20A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈-磷酸水溶液（pH 3.0）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

用紫外分光光度計(jì)對(duì)大豆異黃酮組分混標(biāo)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮在260 nm處有最大吸收，因此選擇260 nm作為檢查波長(zhǎng)。

研究了不同pH的磷酸水溶液和乙腈對(duì)大豆異黃酮各組分的分離和保留時(shí)間的影響，最終選擇pH為3.0的磷酸水溶液作為流動(dòng)相，洗脫梯度見(jiàn)表1。

2.2 大豆異黃酮組分線性關(guān)系

采用“1.2.5”色譜條件對(duì)單個(gè)標(biāo)品進(jìn)行分析，確定大豆異黃酮組分保留時(shí)間為：大豆苷16.014 min、黃豆黃苷17.228 min、大豆苷元34.308 min、黃豆黃素36.013 min、染料木素45.485 min。配制8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 mg/L大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用50%二甲基亞砜定容，用高效液相色譜測(cè)定大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，色譜圖如圖1所示。

2.3 大豆及3種豆制品中大豆異黃酮組分含量 用高效液相色譜法檢測(cè)大豆、豆芽、豆?jié){和豆腐中大豆異黃酮組分含量，其色譜圖如圖2～5所示。計(jì)算4種豆制品中各組分占原料的比重，其結(jié)果如表3所示。

試驗(yàn)表明，大豆及3種豆制品中大豆異黃酮組分各不一樣，其中大豆中大豆異黃酮含量最高；其次是豆芽、豆腐；豆?jié){中大豆異黃酮含量最少，推斷是豆?jié){制作過(guò)程中對(duì)大豆中大豆異黃酮提取不充分。大豆中大豆異黃酮組分含量大小依次為：大豆苷、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木素、大豆苷元；豆芽中大豆異黃酮組分含量大小依次為：大豆苷、染料木素、大豆苷元、黃豆黃素、黃豆黃苷；豆?jié){中大豆異黃酮組分含量大小依次為：染料木素、黃豆黃素、大豆苷、黃豆黃苷、大豆苷元；豆腐中大豆異黃酮組分含量大小依次為：大豆苷、染料木素、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定大豆及3種豆制品中大豆異黃酮組分含量的方法，方法分離度好，準(zhǔn)確度高，能夠滿足日常食品檢測(cè)的需求。該試驗(yàn)對(duì)大豆異黃酮提取過(guò)程未進(jìn)行方法比較，在今后會(huì)進(jìn)一步完善試驗(yàn)。目前，大豆異黃酮及其在藥品、保健品、食品上的應(yīng)用非常普遍。我國(guó)是大豆生產(chǎn)大國(guó)，可為大豆異黃酮的擴(kuò)大生產(chǎn)提供原料保證。研究大豆及3種豆制品中大豆異黃酮組分及含量對(duì)居民合理選擇食用大豆及其制品有指導(dǎo)意義，同時(shí)也對(duì)我國(guó)大豆異黃酮及其深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1]張永忠，孫艷梅.大豆異黃酮研究中的名詞術(shù)語(yǔ)[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，19（4）：50-52.

[2]劉志勝，李里特，辰巳英三.大豆異黃酮及其生理功能研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2000（1）：78-80.

[3]馬麗娟.大豆異黃酮對(duì)心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2006.

[4]胡斌，鄧放明，唐春江.大豆異黃酮的生理功能及檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2008（5）：82-85.

[5]井樂(lè)剛，張永忠.高效液相色譜法測(cè)定大豆乳清提取物中大豆異黃酮的含量[J].植物研究，2006，26（5）：629-632.

[6]曠勇，盧成瑛，龔竹瓊，等.固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵豆制品中4種大豆異黃酮[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（4）：1178-1180.