謝文申 周恒蒼 付晏昆 周宇航

摘要[目的]探討低成本下薄荷脫毒苗的快繁技術(shù)。[方法]以脫毒野薄荷試管苗為外植體，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，配制不同培養(yǎng)基，對液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)的薄荷脫毒苗繼代、生根及移栽過程進(jìn)行了比較。[結(jié)果]淺層液體培養(yǎng)繼代增殖系數(shù)、根長、根數(shù)、生根率均優(yōu)于固體培養(yǎng)；來源于淺層液體培養(yǎng)生根的薄荷脫毒苗移栽成活率明顯高于來源于固體培養(yǎng)基的脫毒苗；與固體培養(yǎng)基相比，采用淺層液體培養(yǎng)可節(jié)約成本57.44%，同時減少大量用工。[結(jié)論]以30 g/L食用白糖代替蔗糖、以涼開水代替蒸餾水的淺層液體培養(yǎng)更適合于脫毒薄荷種苗的大量繁殖。

關(guān)鍵詞 野薄荷脫毒苗；快繁技術(shù)；低成本；淺層液體培養(yǎng)

中圖分類號 S503.53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-174-03

Abstract[Objective]To explore the rapid propagation technique of virusfree mint in vitro with low cost.[Method]With virusfree mint in vitro as explants，1/2 MS was used as the basic medium to prepare different culture mediums. Comparative test between liquid culture medium and solid culture medium was carried out in subculture， rooting and transplanting of virusfree mint.[Result]The multiplication coefficient， root length， root number， and rooting rate in shallow liquid culture were prior to those in solid culture. Virusfree seedlings from shallow liquid culture gad significantly higher survival rate than those from solid culture. The cost of chemicals of shallow liquid culture system reduced by 57.44%； and a large amount of labor force was saved.[Conclusion]The cost can be decreased markedly with 3% edible sugar instead of sucrose and boiled water instead of distilled water. The shallow liquid culture system is proposed during rapid propagation process of virusfree mint.

Key words Virusfree mint； Rapid propagation； Low cost； Shallow liquid culture

薄荷為唇形科薄荷屬多年生草本植物，以全草入藥，用于治療風(fēng)熱感冒、風(fēng)溫初起、頭痛、目赤、喉痹、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙痛、蕁麻疹、風(fēng)疹等[1-2]，是藥食兩用的經(jīng)濟(jì)作物，也是世界三大香料之一，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、香料、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有栽培容易、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)效益好等特點。在薄荷生產(chǎn)中長期采用無性繁殖，反復(fù)重茬，致使薄荷體內(nèi)積累多種病菌病毒，導(dǎo)致優(yōu)良性狀退化，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量降低，對薄荷種植構(gòu)成嚴(yán)重威脅。如何快速獲得大批量的脫毒種苗、降低脫毒種苗的生產(chǎn)成本成為脫毒種苗大量推廣的技術(shù)關(guān)鍵。

近年來，關(guān)于薄荷組培快繁技術(shù)研究較多[3-4]，主要集

中在激素配比在薄荷繼代、誘導(dǎo)和生根上。液體培養(yǎng)在馬鈴

薯、草莓、甘薯、香蕉、生姜[5-11]等幾種作物上的應(yīng)用已有報

道，而應(yīng)用淺層液體培養(yǎng)進(jìn)行薄荷脫毒苗快繁與生根，國內(nèi)鮮見報道。筆者以脫毒野薄荷試管苗為供試材料，對薄荷脫毒試管苗的繼代和生根階段進(jìn)行了淺層液體培養(yǎng)，旨在為其規(guī)?；a(chǎn)提供種苗和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為已經(jīng)鑒定確認(rèn)無毒、且經(jīng)過不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)30 d后的薄荷試管苗。

1.2 培養(yǎng)基

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分裝于100 mL三角瓶中，經(jīng)121 ℃高溫、高壓消毒滅菌20 min，冷卻后備用。具體配方見表1。

以上培養(yǎng)基分別配成固體和液體2種狀態(tài)的培養(yǎng)基；其中固體培養(yǎng)基加入8 g/L瓊脂，30 mL/瓶；液體培養(yǎng)基設(shè)置5、15和20 mL/瓶共3個處理，其他同固體培養(yǎng)基，以涼開水代替蒸餾水。

1.3 試驗方法

接種外植體采用二葉單節(jié)莖段，每個處理10瓶，每瓶接種10個莖段，重復(fù)5次。移栽基質(zhì)分別為土壤（A）、土壤∶珍珠巖=3∶1（B）、珍珠巖（C）。試驗設(shè)3次重復(fù)。

當(dāng)株高達(dá)4～5 cm時從培養(yǎng)室移至普通室2 d，使其適應(yīng)自然環(huán)境，然后打開瓶蓋在室溫下煉苗3 d，最后移栽至不同基質(zhì)中，移栽后第15天統(tǒng)計成活率。

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度（23±2）℃，光照時間12 h/d，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx。25～30 d繼代1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同狀態(tài)培養(yǎng)基對薄荷脫毒苗繼代生長的影響

從表2可以看出，在相同激素水平的培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基增殖系數(shù)均略高于固體培養(yǎng)基。觀察發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的植株生長狀況優(yōu)于固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基中葉片更綠，植株長勢更好。液體培養(yǎng)從第6天開始萌芽，比固體培養(yǎng)基提前2～3 d。雖然液體培養(yǎng)基前期生長速度和成苗率不及固體培養(yǎng)基，但生長后期液體培養(yǎng)的試管苗長勢好，植株健壯，葉大色綠，說明液體培養(yǎng)適合薄荷脫毒苗二葉單節(jié)莖段快繁。這是因為液體培養(yǎng)使外植體與培養(yǎng)基的接觸面積增大，各種養(yǎng)分和激素補(bǔ)充速度快，外植體排出的一些代謝廢物能夠快速擴(kuò)散開，從而提髙了組織的代謝活性。同時，淺層培養(yǎng)時，培養(yǎng)物大部分露在液面上，解決了液體培養(yǎng)透氣性差的問題。

2.2 不同狀態(tài)培養(yǎng)基對薄荷脫毒苗生根的影響

從表3可以看出，薄荷脫毒苗在不同培養(yǎng)基中的生根率均達(dá)100%，從根長和生根數(shù)來看，液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基的根長且條數(shù)多。觀察發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)的株高比固體培養(yǎng)高，葉片更濃綠，植株生長也更旺盛。M5和M6中試管苗的長勢無明顯區(qū)別，從節(jié)約成本的角度考慮，宜采用不加瓊脂、以食用白糖代替蔗糖的M6培養(yǎng)基。

2.3 不同液體培養(yǎng)基用量對薄荷脫毒苗生長的影響

試驗結(jié)果表明，在不同處理的液體培養(yǎng)基中，所有處理芽萌動時間均為轉(zhuǎn)接后第5～6天，轉(zhuǎn)接25 d后，5 mL培養(yǎng)基淺層培養(yǎng)無法滿足薄荷組培苗的增殖生長，而15 mL培養(yǎng)基淺層培養(yǎng)增殖效果明顯優(yōu)于20 mL培養(yǎng)基的增殖效果。這是因為過量的液體易淹埋薄荷組培苗的分生點使其生長緩慢，甚至導(dǎo)致植株因缺氧而溺亡。而15 mL淺層培養(yǎng)并未完全淹沒叢生芽的分生點，不僅能有效地吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)與激素，也能給原生質(zhì)提供有效的伸展空間，繼而保證了叢生芽的萌發(fā)及增殖率。但過于少量的培養(yǎng)基會造成營養(yǎng)與激素供應(yīng)不足，從而影響薄荷組培苗的生長。因此，10～15 mL/瓶（100 mL三角瓶）是薄荷組培苗淺層培養(yǎng)基的最適容量。

2.4 不同基質(zhì)對薄荷脫毒苗移栽成活率的影響

從表4可以看出，無論哪種基質(zhì)，來源于液體培養(yǎng)基的薄荷脫毒苗的成活率在不同移栽基質(zhì)中均高于來源于固體培養(yǎng)基，其中基質(zhì)以土壤∶珍珠巖=3∶1為佳，成活率可達(dá)100.0%。

2.5 淺層液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)的成本比較

從表5可以看出，由于液體培養(yǎng)基M5省去價格較貴的瓊脂，成本比固體培養(yǎng)基M4降低了34.42%；液體培養(yǎng)基M6在M5的基礎(chǔ)上，以廉價的食用白糖替代替蔗糖，其成本比固體培養(yǎng)基M4降低了57.44%。在液體培養(yǎng)基之間，雖然加蔗糖的培養(yǎng)基M5中脫毒苗比培養(yǎng)基M6中生長更旺盛，但M6的根數(shù)、株高2個主要指標(biāo)仍能達(dá)到快速繁殖的要求，也是較為理想的培基養(yǎng)。而以食用白糖替代替蔗糖能使培養(yǎng)基成本下降35.11%，故大規(guī)模育苗中以M6 培養(yǎng)基為宜。

3 結(jié)論與討論

（1）該試驗結(jié)果表明，在相同溫度和光照條件下，在1/2MS+食用白糖25 g/L+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，試管苗均表現(xiàn)為葉大色綠，既不影響增殖效果又可節(jié)省培養(yǎng)基成本，可用于薄荷脫毒苗的繼代培養(yǎng)。采用1/2MS+食用白糖25 g/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基，既節(jié)約了培養(yǎng)成本，又能保證試管苗健壯生長，可用于薄荷脫毒試管苗生根培養(yǎng)。

（2）瓊脂條目前的市場售價是200元/kg左右，在整個培養(yǎng)基生產(chǎn)成本中約占75%。若采用液體培養(yǎng)，且以廉價的食用白糖替代替蔗糖、以涼開水代替蒸餾水生產(chǎn)薄荷脫毒苗，將能顯著降低薄荷脫毒苗規(guī)?；a(chǎn)成本，提高工廠化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，對工廠化育苗具有重要意義。

（3）使用液體培養(yǎng)基，無需加熱溶解，節(jié)省了加熱所耗的電費(fèi)；移栽時，由于液體培養(yǎng)基中未添加瓊脂，清洗階段可節(jié)省大量人工；移栽過程中來源于液體培養(yǎng)基的薄荷脫毒苗成活率高，從而降低了單株薄荷脫毒苗的生產(chǎn)成本。

（4）液體培養(yǎng)基用量不宜過多，以每瓶（100 mL三角瓶）10～15 mL為宜，用量過多，接種莖段完全沉入瓶底會影響通氣，從而導(dǎo)致試管苗成株率降低；用量不足，培養(yǎng)物會因營養(yǎng)不足而無法達(dá)到繼代和移栽的相應(yīng)生長指標(biāo)，從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。培養(yǎng)25 d后營養(yǎng)液消耗殆盡，最好以25 d為一周期進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

（5）液體培養(yǎng)基由于透氣性差，很多植物組織培養(yǎng)很難應(yīng)用該體系。應(yīng)用淺層液體培養(yǎng)進(jìn)行薄荷脫毒苗快繁與生根，國內(nèi)鮮見報道。該試驗采用固態(tài)和液態(tài)2種培養(yǎng)方式，結(jié)果表明，采用液體淺層培養(yǎng)薄荷脫毒苗途徑可行；無論是在薄荷繼代還是生根試驗中，具有相同激素水平的液體培養(yǎng)基增殖與生根在一定程度上均優(yōu)于固體培養(yǎng)基，且采用液體培養(yǎng)基可降低培養(yǎng)成本。

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