李沁婭，孫寶國，鄭福平，黃明泉，孫金沅，孫嘯濤，李賀賀

（1.北京工商大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048； 2.北京工商大學北京市食品風味化學重點實驗室，北京100048； 3.北京工商大學食品質量與安全北京實驗室，北京100048）

11種保健酒中游離氨基酸的比較分析

李沁婭，孫寶國，鄭福平，黃明泉，孫金沅，孫嘯濤，李賀賀

（1.北京工商大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京100048； 2.北京工商大學北京市食品風味化學重點實驗室，北京100048； 3.北京工商大學食品質量與安全北京實驗室，北京100048）

通過使用氨基酸自動分析儀，對國內市場上的11種保健酒中的游離氨基酸進行了定性定量分析，研究結果顯示，11種保健酒中共檢測到25種氨基酸，包含6種人體必需氨基酸，另外，天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、1-甲基組氨酸、乙醇胺、磷酸絲氨酸、鵝肌肽等是首次在保健酒中檢出，并對其進行了定量分析；11種保健酒的總游離氨基酸質量濃度范圍在32.17～1799.14 mg/L之間，其中，寧夏紅枸杞酒（1799.14 mg/L）和沱牌枸杞酒（1183.98 mg/L）的總游離氨基酸含量明顯多于其他保健酒；通過聚類分析，寧夏紅枸杞酒、沱牌枸杞酒與其他酒樣可以明顯區(qū)分開來。

氨基酸自動分析； 保健酒； 游離氨基酸； 定量分析； 聚類分析

中國的保健酒，是指對人體具有保健功能的飲料酒，同時具備有3種屬性，即食品屬性、功能屬性和非藥品屬性［1］。不同保健酒的原料差別很大，其制作方法可分為浸提法、釀制法、配制法［2］。保健酒具有活血化瘀、抗炎癥、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力等保健功能，截止2014年6月，獲得國家審批注冊的保健酒已有529種［3］，并還在持續(xù)增加。

目前，國內針對保健酒的研究，集中在利用各種食品和藥材，如富硒酵母蛋白［4］、多肽液［5］、食用菇［6］、烏毛蕨［7］、杜仲［8］、瑪咖［9］等所具有的保健功能，開發(fā)新的保健酒，通過優(yōu)化其工藝，并對保健功能和營養(yǎng)成分的相關指標進行研究［10］，如抗氧化能力、多酚、黃酮、總糖、氨基酸、原料中特有功效成分等。如李昱鼎［11］利用竹子、茶和糯米，采用黃酒的工藝發(fā)酵制竹茶酒，優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并研究了竹茶酒在體外、體內的抗氧化活性；鄭向華［12］綜述了黑米酒中氨基酸、生物活性肽、碳水化合物、維生素、礦物質、黃酮類物質等營養(yǎng)和保健成分的研究，并介紹了幾種新型的黑米保健酒及其營養(yǎng)保健功效。氨基酸含量不僅是保健食品的重要營養(yǎng)指標之一［13］，還與酒中的一些揮發(fā)性物質的來源有一定關系［14］，也會影響酒精飲料的風味［15］。早在1986年詹炳耀［16］發(fā)現(xiàn)，杜康酒中所測出的氨基酸含量都達不到相應的味覺閾值，但補加勾兌品嘗試驗表明，氨基酸對口味有明顯影響。我國國內對保健酒中氨基酸的研究資料較少，多是對所配制研發(fā)的某種酒樣進行分析［17］，對商品保健酒中的氨基酸分析的文獻較少［18］，且所分析的氨基酸種類在18種內。

氨基酸自動分析儀基于高效陽離子交換樹脂柱分離及柱后茚三酮衍生法對氨基酸進行自動檢測，具有操作簡單、自動化高、重復性好等優(yōu)點［19］。氨基酸分析儀通常分為蛋白質水解系統(tǒng)（鈉鹽系統(tǒng)）和生理體液系統(tǒng)（鋰鹽系統(tǒng)），利用不同濃度和pH值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進行梯度洗脫；鈉鹽系統(tǒng)一次最多分析約25種氨基酸，鋰鹽系統(tǒng)一次最多分析約50種氨基酸，可以更全面的反映氨基酸的信息［20］。本研究通過使用氨基酸自動分析儀，首次采用生理體液系統(tǒng)較全面地分析了市售11種保健酒中游離氨基酸的類別及含量。本研究可為保健酒的營養(yǎng)評價和保健功效提供基礎參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

酒樣：均購自當?shù)爻屑熬W(wǎng)上專賣店，并于4℃下保存。酒樣相關信息見表1。

試劑：5-磺基水楊酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；39種生理體液氨基酸混合標準品：磷酸絲氨酸（Phser）、?；撬幔═aur）、磷酸乙醇胺（Pea）、尿素（Urea）、天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、肌氨酸（Sarc）、α-氨基己二酸（AAAA）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、瓜氨酸（Citr）、α-氨基丁酸（Aaba）、頡氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、胱硫醚（Cysth）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、β-丙氨酸（B-ala）、苯丙氨酸（Phe）、β-氨基異丁酸（Baiba）、高半胱氨酸（Homocys）、γ-氨基丁酸（Gaba）、乙醇胺（Ehan）、羥賴氨酸（Hylys）、鳥氨酸（Orn）、賴氨酸（Lys）、1-甲基組氨酸（1-Mhis）、組氨酸（His）、3-甲基組氨酸（3-Mhis）、鵝肌肽（Ans）、肌肽（Car）、精氨酸（Arg），美國SIGMA公司。

儀器設備：高速冷凍離心機（TGL-16gR），上海安亭科學儀器廠；氮氣吹干儀（BF-2000），北京八方世紀科技有限公司；Biochrom30+全自動氨基酸分析儀，英國Biochrom公司；移液槍（100～1000μL），北京吉爾森科技有限公司；漩渦振蕩混勻器（Vortex Mixers-SA8），英國Stuart公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的配制及定量方法

所購買的標準品中磷酸絲氨酸、牛磺酸、磷酸乙醇胺、尿素、乙醇胺、鵝肌肽、肌肽等不屬于氨基酸的物質，方便起見，本文統(tǒng)一記為氨基酸。由于色氨酸容易分解，標準品混合液中不含色氨酸。

混合標準品中胱氨酸摩爾濃度為0.125 mmol/L，其他氨基酸摩爾濃度均為0.250 mmol/L。將混合標準品分別稀釋成13個不同梯度的標準液，其稀釋倍數(shù)為2倍、2.5倍、4倍、6倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、100倍、200倍、500倍。

將13個不同梯度氨基酸標準溶液同樣條件下進樣，每個濃度重復3次，建立標準曲線。然后進行樣品測試，樣品中檢測出的氨基酸通過保留時間進行定性，最后根據(jù)樣品中所測氨基酸含量區(qū)間，選擇合適的標準品濃度繪制摩爾濃度-峰面積標準曲線，采用外標法進行定量。

1.2.2樣品前處理方法

搖勻酒樣，取3 mL保健酒樣品，加入3 mL 10%的5-磺基水楊酸，搖勻后于4℃冰箱中靜置22 h取出，以10000 r/min離心15 min后取1 mL上清液于進樣瓶，40℃氮吹干后加入1 mL的pH2.2緩沖液，漩渦振蕩混勻，過0.22μm濾膜，上機檢測。每個酒樣2瓶，各取樣2次進行實驗。

1.2.3檢測條件

色譜柱：Biochrom Li型陽離子交換樹脂柱，4.6 mm× 20 cm；柱溫：31～75℃；緩沖液流速：20 mL/h；茚三酮流速：20 mL/h；檢測波長570 nm、440 nm；分析時間125 min，進樣量80μL。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

對11種市售保健酒中所測氨基酸含量用SPSS 20.0采用Ward法-平方Euclidean距離進行系統(tǒng)聚類分析，并繪出樹狀圖，見圖3。

表1　保健酒樣品信息

圖1　39種氨基酸標準品的分離圖譜

2　結果與分析

2.139種游離氨基酸分離圖譜及線性回歸方程建立

39種生理體液氨基酸標準品的分離圖譜見圖1，樣品分離見圖2。除羥脯氨酸和脯氨酸在440 nm波長下檢測外，其余37種氨基酸均在570 nm波長下檢測。

圖2　勁酒樣品的分離圖譜

由圖1和圖2可知，氨基酸分離效果較好，基線干擾少。通過與標準品的保留時間進行比對，11種保健酒共定性出25種氨基酸，其余14種氨基酸有的沒有檢測到，有的被雜峰影響無法定性定量。所測到的25種游離氨基酸的線性回歸方程見表2。由表2可知，除乙醇胺的線性系數(shù)為0.9867外，其余氨基酸的線性系數(shù)在0.9918～0.9996之間，方程線性關系良好。

2.2定量結果分析

保健酒酒樣中25種游離氨基酸的定量結果見表3，表中氨基酸含量用平均值±標準偏差表示，其中磷酸絲氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇胺、鳥氨酸、1-甲基組氨酸、鵝肌肽這10種氨基酸是首次對其在保健酒中的含量進行定量。

由表3可知，11種不同保健酒中總游離氨基酸的含量差別較大，總游離氨基酸質量濃度范圍在32.17～1799.14 mg/L；酒樣H（寧夏紅枸杞酒，1799.14 mg/L）和酒樣B（沱牌枸杞酒，1183.98 mg/L）的總游離氨基酸含量最高，酒樣A（中國勁酒）以463.09 mg/L的含量排名第3，其他酒樣所測得氨基酸含量均小于200 mg/L；酒樣I（茵陳酒，32.17 mg/L）、酒樣D（陽春牌酒，40.17 mg/L）和酒樣K（五加皮酒，55.09 mg/L）中含量較少。在所測酒樣中，酒樣A（中國勁酒）中檢測到特有成分鵝肌肽（6.88 mg/L），酒樣B（沱牌枸杞酒）中檢測到特有成分胱氨酸（2.94 mg/L），酒樣E（人參酒）中檢測到特有成分瓜氨酸（1.70 mg/L），酒樣F（至寶特質三鞭酒）中檢測到特有成分天冬酰胺（9.47 mg/L）。

表2　保健酒樣中所含游離氨基酸的線性回歸方程

表3　保健酒樣中游離氨基酸的定量結果

在所測出的25種氨基酸中，有6種人體必需氨基酸，即纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸，11種保健酒中人體必需氨基酸的總量占總氨基酸的比例不同，在4.67%～19.18%之間；所測酒樣中所含游離必需氨基酸的質量濃度范圍在5.74～95.73 mg/L，酒樣B（沱牌枸杞酒，95.73 mg/L）中含量最多，其次是酒樣H（寧夏紅枸杞酒，83.98 mg/L）、酒樣A（中國勁酒，28.38 mg/L）、酒樣C（椰島海王酒，13.06 mg/L），酒樣D（陽春牌酒，5.74 mg/L）中含量最少。

通過對各酒樣中所測出的游離氨基酸含量從大到小排列，將累計總和達到80%的氨基酸定義為主要氨基酸，見表4。從表3和表4可以看出，精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸在酒樣A、B、D、G、H、K中為含量較高的5種游離氨基酸，酒樣E中最主要的游離氨基酸為精氨酸。通過比較本實驗結果與張莊英［21］等所測大量白酒樣品中游離氨基酸含量可知，整體看來保健酒中的游離氨基酸含量比白酒多，其原因與保健酒中所用原料相關，即保健酒原料中的氨基酸會溶解在酒中。

表4　各保健酒樣中主要的游離氨基酸

根據(jù)所測每種保健酒中各氨基酸的含量，對11種保健酒進行聚類分析，結果見圖3。從樹形圖可以看出，11種保健酒分為2大類：第1類為酒樣B（沱牌枸杞酒）和酒樣H（寧夏紅枸杞酒），這兩種枸杞酒與其他保健酒有比較明顯的差別；第2類分的層次較多，酒樣A（中國勁酒）與酒樣C、D、E、F、G、I、J、K可以區(qū)分開，酒樣E又可與酒樣C、D、F、G、I、J、K再次區(qū)分，可能是由于酒樣E中精氨酸的比例明顯大于其他酒樣。酒樣C、D、G、I、J、K聚為一類，雖然氨基酸含量有差異，但聚類沒有將其明顯區(qū)分開來。聚類結果產生的原因可能與各種保健酒的原料及生產工藝有很大關系。

圖3　11種保健酒中氨基酸的聚類分析圖

綜上所述，保健酒中較高含量的游離氨基酸，不僅包括人體必需的氨基酸，還含有一些功能性氨基酸，這些氨基酸對人體都有重要的生理保健功能。必需氨基酸有甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等，甲硫氨酸參與膽堿的合成，具有去脂、防治動脈硬化高血脂癥的功能，可以提高肌肉活力并促進合成皮膚蛋白質和胰島素；苯丙氨酸在機體內可以轉變?yōu)槔野彼?，促進合成甲狀腺素和腎上腺素；亮氨酸可以促進傷口及骨頭愈合，缺乏亮氨酸會導致機體停止生長，體重減輕［22］。除必需氨基酸外，其他氨基酸也會影響人體的氮平衡及相關生理功能，如γ-氨基丁酸是功能性氨基酸，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質，參與多種代謝活動，具有降血壓、改善腦功能、增強記憶、抗焦慮及提高肝腎機能等生理作用［23-24］；甘氨酸、脯氨酸參與膠原形成及細胞外基質重構，有助于傷口愈合［25］；精氨酸有抗氧化、調節(jié)激素分泌和基因表達、增強免疫力的作用［26］，并與精子的數(shù)量和活動力有關；絲氨酸參與合成半胱氨酸、嘌呤、嘧啶、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸及蛋白質磷酸化［25］。

3　結論

通過使用氨基酸自動分析儀，對11種保健酒中所含游離氨基酸做了定性定量分析，檢測出25種游離氨基酸，其中天冬酰胺、瓜氨酸、胱硫醚、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、1-甲基組氨酸、乙醇胺、磷酸絲氨酸、鵝肌肽等是首次在保健酒中檢出。11種保健酒測得的總游離氨基酸質量濃度范圍在32.17～1799.14 mg/L，不同保健酒中氨基酸含量差別較大。通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)沱牌枸杞酒和寧夏紅枸杞酒與其他酒可以明顯區(qū)分開來，可能與這2種保健酒枸杞原料比例較大、氨基酸含量較高有關。

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Comparative Analysis of Free Amino Acids in 11 Kinds of Healthcare Wine

LI Qinya，SUN Baoguo，ZHENG Fuping，HUANG Mingquan，SUN Jinyuan，SUN Xiaotao and LI Hehe
（1.BeijingAdvanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048；2.Beijing Key Lab of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048；3.Beijing Lab for Food Quality and Safety，Beijing 100048，China）

In this study，free amino acids in 11 kinds of healthcare wine in domestic market were determined quantitatively and qualitatively by using automatic amino acid analyzer.The results suggested that，25 kinds of amino acids in total were detected in 11 kinds of healthcare wine including 6 necessary amino acids；In addition，asparagine，citrulline，cystathionine，β-alanine，γ-aminobutyric acid，ornithine，1-methyl histidine，ethanolamine，phosphoserine and anserine were detected and quantified for the first time in healthcare wine；total free amino acid concentration in 11 kinds of healthcare wine ranged between 32.17 mg/L and 1799.14 mg/L，among them，total free amino acid contents in Ningxiahong wolfberry wine（1799.14 mg/L）and in Tuopai wolfberry wine（1183.98 mg/L）were significantly higher than other healthcare wine. Through cluster analysis，it was found that Tuopai wolfberry wine and Ningxiahong wolfberry wine could be clearly distinguished from other healthcare wine products.

automatic amino acid analysis；healthcare wine；free amino acid；quantification；cluster analysis

TS262.91；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）09-0038-05

10.13746/j.njkj.2016147

國家自然科學基金項目（31471665和31301466）；北京市教委科技計劃重點項目（KZ20140011015）。

2016-04-28

李沁婭（1992-），女，在讀碩士研究生，研究方向為分析檢測，E-mail：liqinya1634051@163.com。

黃明泉（1977-），男，副教授，主要從事食品風味研究，E-mail：hmqsir@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1345.009.html。