李謝晟（高二學(xué)生，項(xiàng)目研究者）張四槐（項(xiàng)目指導(dǎo)教師）

耐超高溫α-淀粉酶的研制

對(duì)射線處理后的地衣芽孢桿菌進(jìn)行篩選，獲得一株能耐100℃高溫的菌株。對(duì)菌株產(chǎn)生的酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶在100℃下，酶活力是27500u/mL，耐高溫性和酶活力指標(biāo)均超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵中試和超濾、鹽析提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是超濾法比鹽析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，成本低20%。酶制劑在酶活力、熱穩(wěn)定性優(yōu)于國(guó)家優(yōu)等品標(biāo)準(zhǔn)，具有實(shí)用價(jià)值。

下文介紹該項(xiàng)目研制的過程。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料和藥品

1.菌株

地衣芽孢桿菌（B.licheniformis），由湖南農(nóng)大提供。

2.培養(yǎng)［1］

（1）瓊脂平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方∶胰蛋白胨1.5g，酵母膏0.7g，NaCl1.0g，瓊脂2.0g，可溶性淀粉1.0g，pH值7.0，其余為水，合計(jì)總重100g。上述100g配料混勻后分放于培養(yǎng)皿，0.1MPa滅菌30-35min，冷卻到室溫，制成瓊脂復(fù)壯培養(yǎng)基備用。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基。不加瓊脂，其他與瓊脂平板培養(yǎng)基相同。

（3）篩選培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上加入2%瓊脂和0.01%曲利本藍(lán)。

（4）擴(kuò)大培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%，NaCl0.9-1.1%，可溶性淀粉1%，pH值6.5-7.0，其余為水，合計(jì)總重5kg，0.1MPa滅菌30-35min，冷卻到40℃，制成擴(kuò)大培養(yǎng)基，備用。

（5）液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：（NH4）2SO40.22-0.27%，KH2PO40.30-0.37%，CaCl20.015-0.02%，可溶性淀粉0.25-0.30%，胰蛋白胨0.35-0.45%，玉米粉2.9-3.5%，pH值6.5-7.0，其余為水，合計(jì)總重50kg，0.1MPa滅菌30-35min，冷卻到40℃，制成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，備用。

3.主要試劑、材料

硅藻土，原碘液，稀碘液［2］，磺化聚砜∶超微濾膜（型號(hào)YM-200），20g/L可溶性淀粉溶液，磷酸緩沖液，NaOH溶液（0.5mol/L），鹽酸溶液（0.1mol/L）。曲利本藍(lán)。

4.主要儀器

板框壓濾機(jī)，Unic7200型可見分光光度計(jì)，PL303型電子天平，HH-6型恒溫水浴鍋，電子萬用爐，PHS-3C型pH計(jì)，離心機(jī)，XK96-B型快速混勻器，高壓消毒器，超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，恒溫箱。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.菌株篩選、分離

取活化培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌，加入裝有45mL無菌水的小三角瓶中，取0.1mL梯度稀釋（10-5、10-4、10-3）涂布到篩選平板上，37℃±1℃培養(yǎng)60h，測(cè)量D/d（水解圈直徑/菌落直徑）值，挑選出比值較大的保存。

之后，將篩選得到的菌純化后進(jìn)行液體培養(yǎng)。培養(yǎng)60h，取培養(yǎng)液離心后收集上清液，經(jīng)超濾濃縮得到酶液，在100℃下進(jìn)行α-淀粉酶活性測(cè)定，選取酶活高的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.產(chǎn)酶發(fā)酵

（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)：取平板培養(yǎng)后的地衣芽孢桿菌，接種于100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，180r/min、36℃±1℃恒溫培養(yǎng)40h。

（2）擴(kuò)大培養(yǎng)：取步聚（1）制成的瓊脂培養(yǎng)基菌種，按擴(kuò)大培養(yǎng)基重0.8%的接種量，接種到冷卻到40℃的擴(kuò)大培養(yǎng)基，36℃±1℃恒溫培養(yǎng)60-70小時(shí)。恒溫培養(yǎng)時(shí)，不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為300-320轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.3-1.5立方氣體/升培養(yǎng)基/分鐘，制成擴(kuò)大培養(yǎng)液。

（3）液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：?。?）步聚的擴(kuò)大培養(yǎng)液，按液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基重2.5-3.5%的接種量，接種到冷卻到40℃的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，36℃±1℃恒溫培養(yǎng)60-70小時(shí)。恒溫培養(yǎng)時(shí)，不斷攪拌通風(fēng)，攪拌速度為300-350轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量為1.3-1.5立方氣體/升培養(yǎng)基/分鐘，制成液態(tài)發(fā)酵液。

2.淀粉酶活力的測(cè)定

國(guó)標(biāo)法——分光光度計(jì)法［2］

方法步驟：吸取可溶性淀粉溶液20.00mL于各具塞試管中→加入緩沖液5.00mL搖勻→控溫5min→加入稀釋好的待測(cè)酶液1.00mL→計(jì)時(shí)、搖勻、準(zhǔn)確反應(yīng)5min→吸取反應(yīng)液1.00mL→加稀碘液5.00mL，搖勻→稀碘液作空白，于波長(zhǎng)660nm處迅速測(cè)定吸光度。

根據(jù)其吸光度查表Al，求得測(cè)試酶液的濃度（c），再計(jì)算酶活力。

X=c×n×16.67。（式中：X—樣品的酶活力（u/mL），c—測(cè)試酶的濃度，n—樣品的稀釋倍數(shù)，16.67—換算常數(shù)）

3.α-淀粉酶最適溫度的測(cè)定：在磷酸緩沖液（pH值6.0）的反應(yīng)體系中［2］，將反應(yīng)溫度分別控制在50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃下，分別用1%淀粉溶液作為底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)，測(cè)量酶活力［2］。

4.α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定［3］：取適量酶液（添加或不添加Ca2+）分別在不同溫度（70℃、80℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃和115℃）下保溫1h后，迅速置于4℃冰箱內(nèi)降溫，然后統(tǒng)一在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定殘余酶活，以未處理的酶液的酶活設(shè)為100%。

5.α-淀粉酶最適pH值的測(cè)定［2］：配制pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的醋酸鹽緩沖液和pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5的Tris-HCl緩沖液，通過改變反應(yīng)體系的pH值，測(cè)定不同pH值下酶活力大小。

6.α-淀粉酶的提取、純化。

（1）方法1：板框壓濾→酶的超濾濃縮及精制。

粗濾：往上述發(fā)酵好的液態(tài)發(fā)酵液中添加液態(tài)發(fā)酵液重4-6%的硅藻土，混合均勻后裝入板框壓濾機(jī)，以0.6兆帕壓力壓濾，實(shí)現(xiàn)固液分離，收集酶的濾液。工作原理是依靠壓緊裝置將濾板壓緊，再將懸浮液用泵壓入濾室，通過濾布來達(dá)到將固體顆粒和液體分離的目的。

酶的超濾濃縮及精制［4］：酶的濾液中含有許多無機(jī)鹽、糖和氨基酸之類的低分子物質(zhì)，它們對(duì)酶制劑的顏色、氣味、酶含量等都有很大的影響。α-淀粉酶的分子質(zhì)量在10000Da-100000Da之間，這個(gè)范圍恰好在超濾技術(shù)應(yīng)用的范圍之內(nèi)。采用超濾技術(shù)過濾粗酶液，低分子物質(zhì)和鹽類可以與水一起經(jīng)膜孔除去，而酶被濃縮和精制。以微濾膜（磺化聚砜）將步聚4粗濾液過濾濃縮5倍，濃縮液以塑料桶裝，在室溫（5-25℃）溫度下保存即可。

（2）方法2：酶的鹽析法濃縮及精制［3］。技術(shù)路線：離心→硫酸銨鹽析→透析、除鹽。具體操作：將發(fā)酵液進(jìn)行離心（40℃，8000r/min，30min），收集上清液取→取上清液，經(jīng)40%硫酸銨鹽析，4℃靜置4h，離心（40℃，9000r/min，30min）取上清夜→以80%硫酸銨鹽析，4℃靜置過夜，離心（40℃，10000r/min，30min）收集沉淀→用少量蒸餾水溶解沉淀，通過透析方法除鹽。

二、結(jié)果與分析

1.菌株篩選、分離結(jié)果

用選擇平板進(jìn)行初篩，以水解圈大小為指標(biāo)，初篩到5個(gè)菌落（分別標(biāo)號(hào)為：ABCDE）對(duì)這五個(gè)菌落進(jìn)行3次劃線分離、純化。

把A、B、C、D、E菌分別進(jìn)行液體培養(yǎng)，收集酶液，在100℃下測(cè)α-淀粉酶活性，C、D菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶在100℃下有活性，其中D菌株較高，為27500u/mL。

2.酶的作用溫度

實(shí)驗(yàn)測(cè)定溫度對(duì)α-淀粉酶活性影響的結(jié)果如表1。

溫度℃70℃80℃85℃90℃95℃100℃105℃110℃115℃酶活力（u/mL）7000 11000 14800 19500 23000 27500 28300 22500 11000

數(shù)據(jù)表明，菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶在pH值為6.0時(shí)，酶作用的最適溫度為105℃左右。105℃時(shí)，酶活力為28300u/mL。在110℃仍有81%的酶活力，以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)2000u/mL考慮，適宜溫度范圍92-110℃。從70℃到105℃，隨溫度升高，活性增長(zhǎng)；超過105℃，酶活性隨溫度升高而降低。

3.酶的熱穩(wěn)定性

酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

溫度70℃80℃90℃95℃100℃105℃110℃115℃對(duì)照組相對(duì)酶活力100% 100% 100% 100% 100% 95% 80% 40% 100%

數(shù)據(jù)表明在最適溫度105℃下處理1小時(shí)后，酶耐熱性存活率95%，100℃以下酶耐熱性存活率100%。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［2］為：酶耐熱性存活率95℃，60min大于或等于95%。說明此α-淀粉酶熱穩(wěn)定性好，高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

4.反應(yīng)pH值對(duì)酶活性的影響

表3反應(yīng)pH值對(duì)酶活性的影響

從表3可以看出，該酶的最適pH值為5.5左右，在pH值5.0-6.5之間，酶活性在80%以上，是一種適合偏酸型的α-淀粉酶。pH值在4.0-5.5時(shí)，隨pH值升高，酶活性增強(qiáng)。超過5.5，隨PH值升高，酶活性降低。

5.α-淀粉酶的提取、純化

發(fā)酵液經(jīng)兩種提取、純化方法分別得到發(fā)酵上清液、硫酸銨沉淀純化液，板框壓濾液、超濾純化液，對(duì)上述四種提取物進(jìn)行酶活、回收率、純化倍數(shù)進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算

兩種分離純化結(jié)果如表4。

表4α-淀粉酶分離純化

進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方法1與方法2相比，P＜0.01，差異顯著。數(shù)據(jù)表明，超濾法比鹽析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，說明超濾法比鹽析法在收到的酶數(shù)量、酶活性高，且差異顯著。超濾法提取成本低20%。

三、討論

淀粉的水解過程通常包括兩步：液化和糖化。在液化階段，淀粉顆粒在噴射罐105-110℃經(jīng)過5min的高溫噴射糊化成液狀。如果糊化溫度低于105℃，則淀粉糊化不完全，將影響后續(xù)的過濾過程。但目前使用的α-淀粉酶最適作用條件為90℃，在溫度高于100℃時(shí)，會(huì)使酶失活。因此耐超高溫α-淀粉酶成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究用地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）發(fā)酵產(chǎn)生的耐超高溫α-淀粉酶最適溫度為105℃，在110℃仍有81%的酶活力且酶活力超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，適合理想的液化條件。酶活力為28300u/mL，比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)20000提高了41%，催化效率高，降低生產(chǎn)成本，因此該酶有實(shí)用價(jià)值。

酶制劑的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是發(fā)酵、絮凝沉淀、過濾、溶劑萃取、真空蒸發(fā)、干燥，其生產(chǎn)過程能耗高、酶失活率高、收率低。膜分離技術(shù)具有節(jié)約能源、降低損耗、可在常溫下連續(xù)操作、過程簡(jiǎn)單、高效、無相變、分離系數(shù)較大等優(yōu)點(diǎn)［5］。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對(duì)于α-淀粉酶的提取，超濾法比鹽析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，成本低，說明超濾法適合α-淀粉酶的分離、提純。

此酶制劑符合國(guó)標(biāo)，是一種應(yīng)用廣的α-淀粉酶制劑，具有應(yīng)用推廣價(jià)值。

（作者單位：婁底市第三中學(xué)婁底市第五中學(xué)）

［1］陳晨．耐高溫α-淀粉酶菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶基因的克?。?009中南大學(xué)碩士論文

［2］中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T2306 -1997，耐高溫α-淀粉酶制劑．

［3］王淑軍、陸兆新、秦松等．超嗜熱古菌耐熱酸性α-淀粉酶的發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)研究［J］，海洋與湖沼，2009年1月．

［4］李香莉，呂莉萍，肖凱軍．膜分離技術(shù)在酶制劑工業(yè)中的應(yīng)用［J］．食品研究與開發(fā)．

［5］石方方，焦國(guó)寶，丁長(zhǎng)河，屈建航，屈凌波，劉仲敏．耐酸耐高溫α－淀粉酶的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)食品添加劑，2014年第4期．