陳明喆，何　偉

(1. 鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000；2. 湖北理工學院醫(yī)學院，湖北 黃石 435000)

?

論著

橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中Nephrin蛋白表達的影響研究

陳明喆1，2，何偉1，2

(1. 鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000；2. 湖北理工學院醫(yī)學院，湖北 黃石 435000)

目的探討橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中Nephrin表達是否有調(diào)節(jié)作用及其作用機制。方法選取雄性SD大鼠60只，適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為正常組、模型組和橙皮苷組，每組20只。除正常組外，其余組均造模。造模成功后，橙皮苷組給予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃，模型組和正常組給予生理鹽水1 mg/(kg·d)灌胃，均1次/d。分別于造模6周、10周及灌胃干預4周、8周檢測各組大鼠尿紅細胞計數(shù)；分別于灌胃干預4周、8周檢測24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮水平，采用免疫組化、Western blot法檢測腎臟組織中Nephrin蛋白表達情況，采用RT-PCR法檢測腎臟組織中Nephrin mRNA表達情況。結(jié)果與正常組相比，模型組大鼠毛發(fā)雜亂，飲食減少，橙皮苷組干預后毛色、飲食進水及活動度較模型組有一定改善。造模6周、10周及灌胃干預4周、8周，模型組和橙皮苷組尿紅細胞計數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃干預4周、8周后，橙皮苷組尿紅細胞計數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05)。灌胃干預4周、8周后，模型組24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮水平均明顯高于正常組 (P均<0.05)，Nephrin蛋白和mRNA表達均明顯低于正常組(P均<0.05)；灌胃干預4周后，橙皮苷組24 h尿蛋白定量和尿素氮水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，Nephrin蛋白和mRNA表達均明顯高于模型組(P均<0.05)；灌胃干預8周后，橙皮苷組24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，Nephrin蛋白和mRNA表達均明顯高于模型組(P均<0.05)。結(jié)論橙皮苷能明顯降低IgA腎病大鼠24 h尿蛋白定量，減少尿紅細胞計數(shù)，保護腎功能，這可能與其可上調(diào)腎臟組織中Nephrin 蛋白和mRNA 的表達有關。

橙皮苷；IgA腎病；腎功能；Nephrin蛋白

IgA腎病(IgAN)是臨床中最為常見的一種原發(fā)性腎小球疾病，好發(fā)于青少年，積極救治多數(shù)較易康復，但其中約有30%的患者康復困難，這與其發(fā)病機制較為復雜有關[1]。本病癥狀較為典型，一般患者表現(xiàn)有血尿或者鏡下有30%的紅細胞即可懷疑，經(jīng)腎活檢如患者有明顯的腎小球系膜區(qū)IgA顆粒物沉積即可確診[2]。該病可以繼發(fā)于過敏性紫癜、酒精性肝硬化以及腫瘤等疾病[3]。目前西藥治療本病多以降壓+激素治療為主，這可能會對患者今后的健康有一定影響[4]。而中藥治療本病有獨特的優(yōu)勢，但是在現(xiàn)代化推廣時，面臨著藥物成分眾多，治療機制不明確的困境[5]。橙皮苷是從橙皮中提取的一類苷類單體化合物，目前已有用橙皮苷治療腎病的研究報道[6]，但是關于其治療IgA腎病的研究報道少見。因此本研究觀察了橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中Nephrin表達是否有調(diào)節(jié)作用及其作用機制，旨在為今后中藥的開發(fā)和本病的治療提供參考。

1　實驗資料

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠60只，購于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心，體質(zhì)量180～200 g，動物合格證號：SCXK(鄂)2011-0007。所有大鼠在購買后均飼養(yǎng)于不銹鋼鼠籠內(nèi)，常規(guī)飼料由華中科技大學動物實驗中心提供，飲用水為純水，飼養(yǎng)于動物飼養(yǎng)間，設置溫度為20～24 ℃，日照和光照共計12 h。

1.2主要試劑橙皮苷購于湖北合天化工有限公司；脂多糖和牛血清白蛋白購于美國Sigma公司；四氯化碳和蓖麻油購于中國國藥公司；免疫組化試劑盒、總蛋白提取試劑盒以及PCR定量試劑盒購于武漢谷歌生物科技有限公司；Nephrin抗體購于美國Santa公司；β-actin購于EPIT Mics公司；Nephrin引物由上海生工生物公司設計并生產(chǎn)。

1.3實驗方法大鼠在適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為正常組、模型組以及橙皮苷組，每組20只。除正常組外，其余2組大鼠均根據(jù)文獻[7]方法進行造模：采用隔日的血清白蛋白400 mg/(kg·d)灌胃，1次/d,持續(xù)6周；同時每周注射1次0.5 mL蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，共9周，分別于第6周和第8周尾靜脈注射脂多糖0.05 mg；10周后觀察大鼠是否造模成功。造模成功后，橙皮苷組給予橙皮苷10 mg/(kg·d)灌胃，模型組和正常組給予生理鹽水1 mg/(kg·d)灌胃，1次/d,分別于灌胃干預4周、8周后處死大鼠各半進行指標觀察。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠一般情況實驗過程中觀察大鼠體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)、飲食量以及日?；顒忧闆r。

1.4.224 h蛋白尿定量及尿紅細胞計數(shù)分別于造模6周、10周以及灌胃干預4周、8周后用大鼠代謝籠收集各組大鼠尿液，采用磺柳酸-硫酸鈉比濁法測定24 h蛋白尿定量，采用尿沉渣計數(shù)法檢測尿紅細胞計數(shù)。

1.4.3血肌酐(SCr)以及尿素氮(BUN)水平處死大鼠后，用注射器沿大鼠心尖處取血，取血后立即4 000 r/min離心，離心后收集血清，將其置于超低溫冰箱保存，由黃石市中心醫(yī)院檢驗科檢測SCr和BUN水平。

1.4.4顯微鏡下腎組織Nephrin表達檢測血清收集后立即取出大鼠腎臟組織，統(tǒng)一切取約1/4左腎臟(其余組織置于超低溫冰箱中備用于檢測Nephrin蛋白和mRNA表達情況)，置于中性福爾馬林溶液中固定。然后取出洗凈，將其置于融化的石蠟中包埋，切片，置于65 ℃烘箱中烘片2 h脫蠟，之后用PBS洗滌3次，每次5 min。將洗凈后的切片置于EDTA緩沖液中修復，待其修復后自然冷卻，再用PBS洗滌3次，每次5 min。將切片置于3%的雙氧水孵育10 min后，用 PBS洗滌3次，每次5 min。將切片用5%BSA蛋白封閉20 min，之后加入一抗過夜，用 PBS洗滌3次，每次5 min。之后加入二抗孵育50 min，再用PBS洗滌3次，每次5 min。用DAB溶液滴加于切片上，顯微鏡下控制顏色，待顏色適宜后用自來水沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗，氨水返藍后沖洗即完成。切片脫水并干燥，之后用二甲苯透明，中性樹膠封固。帶有照相功能的顯微鏡下照片采樣。

1.4.5腎組織Nephrin mRNA檢測采用半定量RT-PCR法檢測。稱取30 mg腎臟組織，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取后定量調(diào)平，之后行逆轉(zhuǎn)錄以及擴增反應，Nephrin引物設計：上游為5’-GATCGCGAGCTAAATACGGCA CC-3’，下游為5’-TGGGAACGCAGCCAGACGACTC-3’，產(chǎn)物長度為312 bp；β-actin上游為5’-CAGAGGAGCCTCCTGTCCAGCTCTCAT-3’，下游為5’-GCTTGA CCAAGCCGCTTCGGTGCAC，產(chǎn)物長度為631 bp。反應條件為94 ℃預變性2 min，之后同樣溫度變性30 s，48.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；最后再延伸5 min。完成后每組各取2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完成后采用凝膠成像儀照片，并分析電泳帶灰度值，全組以β-actin為內(nèi)參，每組實驗重復3次。

1.4.6腎組織Nephrin蛋白表達檢測采用Western blot法檢測。首先用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，之后BCA法定量調(diào)平，最后再測定1次，當總蛋白基本位于(100±5)%后再進行以下實驗。實驗時每組各取50 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后切取目標蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(美國Santa公司)，轉(zhuǎn)移后用脫脂牛奶封閉2 h，洗滌3次后加入一抗過夜，洗滌后加入二抗2 h后再洗滌，最后進行ECL熒光照片，以β-actin 作為內(nèi)參，凝膠成像儀分析系統(tǒng)掃描并定量膠片條帶灰度值，每組實驗重復3次。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠一般情況造模前所有大鼠均靈活好動，同時毛發(fā)順暢且致密有光澤，飲食均正常；造模第6周可見造模大鼠均出現(xiàn)明顯消瘦，飲食和飲水及活動量均明顯減少，同時毛色發(fā)黃、稀疏；橙皮苷組給予橙皮苷干預后，相較于正常組依然較為消瘦，但毛發(fā)稀疏情況較模型組有明顯改善，飲食和飲水均有一定的增加。

2.2各組造模6周、10周及灌胃干預4周、8周后大鼠尿紅細胞計數(shù)比較造模6周、10周后，模型組和橙皮苷組尿紅細胞計數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)。橙皮苷組給予橙皮苷干預4周、8周后，尿紅細胞計數(shù)均明顯低于模型組(P均<0.05)，但仍明顯高于正常組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組造模6周、10周及灌胃干預4周、8周后大鼠尿紅細胞計數(shù)比較±s，個)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組灌胃干預4周和8周后腎功能指標比較灌胃干預4周和8周后，模型組和橙皮苷組血清SCr、BUN和24 h尿蛋白定量均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃干預4周后，橙皮苷組BUN和24 h尿蛋白定量均明顯低于模型組(P均<0.05)；灌胃干預8周后，橙皮苷組SCr、BUN和24 h尿蛋白定量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組灌胃干預4周和8周后腎功能指標比較±s)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.4各組灌胃干預4周和8周后免疫組化表現(xiàn)腎臟組織中Nephrin蛋白主要表達于細胞間隙之間，在細胞核中幾乎沒有表達。灌胃干預4周和8周后，模型組腎臟組織中Nephrin蛋白表達均明顯少于正常組；灌胃干預4周后，橙皮苷組腎臟組織中Nephrin表達有一定升高，干預8周后相較于干預4周后進一步升高。見圖1。

圖1　灌胃干預4周、8周后各組腎臟組織中Nephrin免疫組化表現(xiàn)(10×20)

2.5各組灌胃干預4周和8周后腎臟組織中Nephrin蛋白和mRNA表達情況灌胃干預4周和8周后，模型組和橙皮苷組腎臟組織中Nephrin蛋白和mRNA表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)；灌胃干預4周、8周后，橙皮苷組腎臟組織中Nephrin蛋白和mRNA表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖2～5和表3。

圖2　灌胃干預4周后各組大鼠腎臟組織中Nephrin蛋白表達情況

圖3　灌胃干預8周后各組大鼠腎臟組織中Nephrin蛋白表達情況

3　討　　論

IgA腎病是嚴重威脅人們健康的一種疾病，其發(fā)病機制尚未完全闡明[8]。現(xiàn)有的證據(jù)顯示，免疫反應、遺傳、氧化應激、炎癥反應等均直接或間接參與了該病的發(fā)生和發(fā)展[9-11]。

圖4　灌胃干預4周后各組大鼠腎臟組織中Nephrin mRNA表達情況

圖5　灌胃干預8周后各組大鼠腎臟組織中Nephrin mRNA表達情況

組別nNephrin蛋白灌胃干預4周后灌胃干預8周后NephrinmRNA灌胃干預4周后灌胃干預8周后正常組101.22±0.321.34±0.381.16±0.311.31±0.42模型組100.49±0.14①0.62±0.13①0.39±0.19①0.61±0.23①橙皮苷組100.69±0.22①②1.04±0.19①②0.65±0.21①②1.17±0.33①②

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

由于IgA本身是一種免疫球蛋白，所以認為其是IgA腎病發(fā)病的關鍵，但是為何種原因引起的IgA分泌異常還沒有完全闡明。有研究顯示IgA腎病具有家族和種族遺傳性，我國該病的發(fā)病率明顯高于西方國家，推測遺傳因素或者說是家族性的基因缺陷是導致本病發(fā)生的根本[12]。目前西醫(yī)對于IgA腎病尚無標準的治療方法，臨床中除控制血壓和減少蛋白尿外，部分患者還給予激素治療，而激素治療不良反應大[13]，給患者帶來了嚴重的身心負擔。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學治療核心首先為尋找不良反應較少的藥物，但是祖國醫(yī)藥多以中藥湯劑治療為主，在進行國際化推廣時，面臨著一定的困難，這主要與中藥湯劑成分復雜、藥理學不明有關，因此研究中藥提取物作用意義重大。

近些年來，我國各中醫(yī)藥大學和機構(gòu)引進大量生物和基礎醫(yī)學人才，這些人才的引進將生物醫(yī)療技術(shù)帶到了中藥學界，其提取的眾多中藥單體或化合物用于治療IgA腎病也收到了明顯效果[14-15]。橙皮是我國經(jīng)典的藥物之一，其具有理氣化痰、健脾導滯之功效，此外其對胸腹脹痛、感冒咳嗽以及食欲不振等也具有很好的療效[16]。橙皮苷是從橙皮中提取的一類化合物，其在維持患者的滲透壓、增強毛細血管的韌性、降低膽固醇及對糖尿病和心腦血管的輔助治療方面具有很好的療效[17]。本研究結(jié)果顯示，橙皮苷可改善IgA腎病大鼠善腎功能，降低24 h尿蛋白定量，減少尿液中紅細胞計數(shù)。

Nephrin蛋白是腎小球基底膜中常見的一種蛋白，也是足細胞中的一種重要銜接蛋白，其僅表達于胎兒和成人的腎臟組織，是腎臟的專一性蛋白，對維持腎臟的功能起著舉足輕重的作用[18]。有研究顯示，Nephrin可以黏附于足細胞表面，進而維持足細胞中肌動蛋白的功能，增強足細胞濾過功能[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組腎臟組織中Nephrin蛋白和mRNA表達量明顯低于正常組，這可能是造成IgA腎病大鼠尿紅細胞計數(shù)增多的原因；橙皮苷干預后，腎臟組織中Nephrin蛋白和mRNA表達量均明顯高于模型組，從而提高了腎臟足細胞的肌動性，最終減少了尿液紅細胞的排出。

綜上所述，橙皮苷能明顯降低IgA腎病大鼠24 h尿蛋白定量，減少尿紅細胞計數(shù)，保護腎功能，這可能與其可上調(diào)腎臟組織中Nephrin蛋白和mRNA的表達有關。

[1]孫偉,曾安平,王鋼,等. IgA腎病中醫(yī)病理機制的探討[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,1999，18(4):522-523

[2]Soltani S,Hafshejani AM,Salehiniya H. Trend of disability prevalence in Iran:An evidence to improve disability data[J]. J Res Med Sci,2015,20(5):531-532

[3]向旭. 嗎替麥考酚酯聯(lián)合黃葵膠囊治療老年IgA腎病療效觀察[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015，24(26):2925-2927

[4]鄒粵,于雪蓮. IgA腎病現(xiàn)代研究進展[J]. 光明中醫(yī),2015，30(3):663-665

[5]汪力,王少清. IgA腎病的發(fā)病機制及治療進展[J]. 醫(yī)學綜述,2015，21(15):2712-2714

[6]殷章紅,羅鵬程,王才英. 橙皮苷抑制JNK信號通路輔助治療2型糖尿病大鼠[J]. 長春中醫(yī)藥大學學報,2015,31(3):460-462

[7]史炯,金曉明. IgA腎病動物模型研究進展[J]. 中華腎臟病雜志,2014,30(5):556-558

[8]許成武,王長江. IgA腎病發(fā)病機制研究進展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,18(19):2355-2356

[9]羅月中. IgA腎病中西醫(yī)研究近況[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,13(19):2635-2638

[10] 王乾了,李貴森. 動物模型與IgA腎病的發(fā)病機制研究[J]. 中華腎病研究電子雜志,2014，3(2):18-22

[11] 陳玲,吳小燕. IgA腎病臨床診治指南(解讀)[J]. 臨床內(nèi)科雜志,2015，32(5):358-360

[12] 陳梅,廖蘊華. 原發(fā)性IgA腎病流行病學進展[J]. 醫(yī)學研究雜志,2007,36(11):24-26

[13] 程軍. IgA腎病藥物治療的系統(tǒng)評價[D]. 杭州：浙江大學,2010

[14] 李靜. 雙倍劑量雷公藤多苷在大量蛋白尿型IgA腎病中的療效觀察[J]. 中國醫(yī)藥導報,2007,4(16):59

[15] 吳萍,朱淳. 雷公藤多苷對IgA腎病者腎功能、TGF-β1和部分免疫指標的影響效果觀察及其探討[J]. 中國醫(yī)藥導報,2012,9(28):82-84

[16] 黃燕玲,羅宗銘. 橙皮提取物的抗氧化作用研究[J]. 廣東化工,2001,28(4):32-33

[17] 方巖雄,張焜. 橙皮的綜合利用[J]. 廣東工業(yè)大學學報,1994(S1):86-91

[18] Gagliardini E,Benigni A,Tomasoni S,et al. Targeted downregulation of extracellular nephrin in human IgA nephropathy[J]. Am J Nephrol,2003,23(4):277-286

[19] 湯穎,婁探奇,馬小琨,等. IgA腎病患者IgA1對足細胞nephrin mRNA表達的影響[J]. 中華腎臟病雜志,2007,23(10):673-674

Study on the effect of Hesperidin on the expression of Nephrin in renal tissue of rats with IgA nephropathy

CHEN Mingzhe1,HE Wei1,2

(1. Huangshi Central Hospital,Huangshi 435000, Hubei, China;2.The Medical College of Hubei Polytechnic University,Huangshi 435000, Hubei, China)

Objective It is to investigate whether hesperidin has regulation on Nephrin expression in kidney tissue in IgA nephropathy rats. Methods After adaptive feeding for 2 week, 60 male SD rats were randomly divided into normal group, model group and hesperidin treatment group, each group had 20 rats. Except normal group, model establishing was performed in the other groups.After successful model establishing, hesperidin treatment group was given hesperidin 10 mg/(kg·d) by lavage, while model group and normal group were given normal saline once per day.Urine red blood cell element was detected in 6, 10 weeks after model establishing and at 4 and 8 weeks’ intervention in every group, and 24 h urine protein, serum creatinine and urine nitrogen content were determined at 4 and 8 weeks’ intervention. Immunohistochemistry, Western blot and RT-PCR were used to detected the Nephrin mRNA and protein expression.Results Compared with normal group,the rats in model group was messy hair, their diet significantly reduced. After treatment, the rats’ hair color, diet intake and activity were improved in hesperidin treatment group compared with model group.Compared with normal group, urine red blood cells increased significantly in model group and treatment group(P<0.05), but after intervention it was lower in treatment group than that in model group(P<0.05). Compared with normal group, 24 h urinary protein, serum creatinine and urea nitrogen increased significantly in the other two groups.After 4 and 8 weeks’ intervention, the levels of 24 h urinary protein and urea nitrogen were lower while the levels of Nephrin protein and mRNA expression were significantly higher in treatment group than that in model group(P<0.05); After 8 weeks of treatment, the level of serum creatinine was also lower two (P<0.05). further increased. Conclusion Hesperidin can obviously reduce 24 hours urine protein of the IgA nephropathy rats, and decrease the urine red blood cell count, protect renal function, the mechanism may be related with up-regulation of the expression of Nephrin mRNA and protein in kidney tissue.

Hesperidin; IgA nephropathy; renal function; Nephrin Protein

陳明喆，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療腎臟病。

何偉，E-mail:hsyiyuantougao@163.com

湖北省衛(wèi)生廳資助項目(2014HS017)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.26.001

R-332

A

1008-8849(2016)26-2851-05

2016-05-05