喬健敏， 張家超， 鄭 藝， 侯強川， 黃衛(wèi)強， 霍冬雪， 郭 壯， 張和平

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

無錫城鄉(xiāng)年輕居民腸道菌群多樣性研究

喬健敏， 張家超， 鄭 藝， 侯強川， 黃衛(wèi)強， 霍冬雪， 郭 壯， 張和平*

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

采用PCR和DGGE相結合的技術，研究了生活于無錫城市和鄉(xiāng)村的青年志愿者腸道菌群的多樣性?；贒GGE指紋圖譜，使用聚類和PCA分析對志愿者腸道微生物相似性進行分析，使用Shannon-Weine多樣性指數（H）、豐度（S）和均勻度（EH）對志愿者腸道微生物多樣性進行分析，對圖譜中具有代表性的共性和特異性條帶進行膠回收和測序以分析志愿者腸道微生物組成；基于PCR技術在種水平上對城鄉(xiāng)志愿者腸道內乳桿菌屬 （Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）多樣性進行定性分析。結果顯示，無錫城鄉(xiāng)青年居民間腸道微生物群落結構存在分開趨勢，相似性小于城市或鄉(xiāng)村居民內部；多樣性方面差異不顯著；不動桿菌屬、雙歧桿菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬和瘤胃球菌屬為城鄉(xiāng)青年居民腸道內的共有菌屬；乳桿菌屬Lactobacillus（L.）和雙歧桿菌屬Bifidobacterium（B.）各類菌群在城鄉(xiāng)居民腸道內分布差異不顯著，其中L.plantarum，L.casei，L.salivarius和L.acidophilus以及B.longum，B.breve，B.animalis 和B.adolescentis分別為無錫青年居民腸道內的優(yōu)勢乳桿菌和雙歧桿菌。綜上分析，初步揭示了無錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著。

無錫城鄉(xiāng)年輕居民；微生物多樣性；PCR技術；DGGE技術

17世紀50年代，在微生物學之父列文虎克借助自己發(fā)明的顯微鏡開始研究微生物的同時，關于人類腸道微生物的研究也隨之開始［1-2］。據報道，健康成年人腸道微生物的總數達1014個，10倍于人體細胞，其微生物基因數量約為300萬個，約為人類基因組基因數量的100倍。因此，研究者們將人體腸道微生物基因組稱為人體的第二基因組［3］。這些微生物與宿主共進化，直接參與人體的能量代謝和免疫系統(tǒng)的調節(jié)，對于人的健康扮演著重要的角色［4］。

隨著科學家使用不同的技術手段對不同年齡、不同國籍、不同遺傳背景和生活習慣的人群腸道微生物的研究，發(fā)現人體的腸道微生物多樣性在宿主2歲后開始趨于穩(wěn)定并成人化，此后，隨著宿主進入成人期，生活方式和飲食習慣成為影響宿主腸道微生物群落結構的更重要的因素［4-5］。早于1974年，Finegold［6］等通過對堅持傳統(tǒng)日式飲食習慣的日本居民和已適應西方飲食習慣的日裔美國居民的腸道微生物進行研究，結果顯示兩類人群的腸道菌群結構明顯不同。近些年，Wu等［7］通過對98個健康志愿者的腸道菌群進行研究，發(fā)現居民的腸道菌群可以劃分為2個分別以擬桿菌屬（Bacteroides）和普氏菌屬（Prevotella）為核心的獨立無交集的enterotype類型。enterotype類型的形成與長期的膳食有關，與性別以及肥胖等因素無關。Wu等進一步指出，長期食用高蛋白質高脂肪的食物能夠促使腸道內擬桿菌屬（Bacteroides）細菌的生長，而食用富含碳水化合物和單糖的食物則可以增加人腸道內普氏菌屬（Prevotella）細菌的含量。

中國是一個陸地面積約960萬平方千米的大國，不同地區(qū)具有不同的氣候、文化和飲食習慣。而不同的人群具有不同的腸道菌群結構［8］。無錫地處中國東部長江三角洲地區(qū)，是傳統(tǒng)的魚米水鄉(xiāng)，受吳文化的浸育，形成了典型的南方生活方式和飲食習慣，而城市和鄉(xiāng)村因地理位置的不同生活方式也存在差異。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE）是一種不依賴于培養(yǎng)過程而對復雜微生物群落結構進行有效分析的分子生物學技術，因其具有低成本、可靠、可重復、操作方便等優(yōu)點，近些年被廣泛應用于微生物群落結構的研究［9］。Yoshida等［10］使用PCR-DGGE技術對太平洋、東海、東京灣以及荒川（Arakawa River）水環(huán)境中的放線菌進行評價，結果發(fā)現不同位置水環(huán)境中的放線菌群落結構不同，且同一水環(huán)境中不同深度微生物群落結構也不同。劉慧杰等［11］通過使用PCR-DGGE技術對紅樹林沉積物中細菌群落結構進行研究，證實PCRDGGE技術更能客觀地反映紅樹林沉積物中真實的細菌群落結構信息，同時也證明紅樹林區(qū)域微生物多樣性豐富，表明未知微生物資源的開發(fā)研究具有巨大的潛力。

本文作者應用PCR和DGGE相結合的技術對生活于無錫市區(qū)和鄉(xiāng)村的青年居民腸道菌群多樣性進行研究，并結合城鄉(xiāng)居民生活環(huán)境和飲食習慣分析，探索了無錫城鄉(xiāng)居民腸道菌群多樣性的異同。

1 材料與方法

1.1 樣本和試材

1.1.1 樣本來源 選擇16位居住于無錫城市和鄉(xiāng)村、近一周內無出行記錄的本地居民為研究對象，志愿者年齡均在19～35歲，身體質量指數（BMI）在18.5～25.0，近3個月內無抗生素類藥物攝入，并簽訂知情同意書。同時，根據食品頻率問卷調查（Food frequency questionnaire，FFQ）記錄志愿者近3日膳食信息，并根據《中國食物成分表》計算志愿者脂肪、蛋白質和碳水化合物等營養(yǎng)成分的日攝入量［12］，樣品采集點分別為無錫鄉(xiāng)村的濱湖區(qū)和城市的崇安區(qū)，各采樣點間距離近100 km，具體樣品信息見表1。

1.1.2 試驗所用試劑 試驗所用引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，16S rRNA基因V3區(qū)擴增試劑均購于北京全式金生物技術有限公司，其它試驗藥品均為大連寶生物技術有限公司產品。

表1 樣品信息Table1 Information of subjects

1.2 試驗方法

1.2.1 糞便樣品采集 早餐前分別采集志愿者新鮮糞便樣品適量，放入采樣管中，并立即加入適量保護劑（Takara Biotechnology，Dalian），糞便和保護劑體積比為1∶2，迅速在液氮中速凍后存放于冷凍環(huán)境，72 h內送回實驗室于-80℃冷凍儲存以備用。

1.2.2 糞便菌體基因組DNA提取 糞便菌體基因組 DNA的提取使用 QIAamp DNA stool mini kit （Qiagen）試劑盒［13］。得到的基因組DNA用ND-1000型微量紫外分光光度計測定濃度及A260/A280值，同時用1 g/dL的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，調整DNA質量濃度至ng/μL水平，于-20℃冷凍保存以用于后續(xù)試驗。

1.2.3 基因組DNA 16S rRNA V3區(qū)PCR擴增 使用通用引物V3F+GC（5′-GCCGCCCGGGGCGCGCC CCGGGCGGCCCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和V3R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）進行16S rRNA基因V3區(qū)擴增，擴增片斷長度為220 bp，所用儀器為Applied biosytems公司PCR儀。PCR反應體系 （50 μL）為：10×PCR緩沖液5 μL，dNTP （2.5 mmol/μL）4 μL，引物（10 pmol/μL）各1.5 μL，模板DNA（100 ng/μL）1.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。擴增反應程序為：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃7 min。得到的PCR產物用1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，其余置于-20℃冷凍保存以用于后續(xù)DGGE分析［14］。

1.2.4 糞便菌體基因組DNA變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析 使用 DCode Universal Mutation Detection System（Bio-Rad）儀器，對16S rRNA基因V3區(qū)擴增產物進行DGGE分析。分析所用變性劑質量分數為8%，變性梯度為質量分數27%～52%，灌膠后電泳在60℃，200 V運行5 h。使用銀染方法對所得膠圖進行染色，拍照獲得DGGE指紋圖譜［9］。

1.2.5 乳桿菌屬和雙歧桿菌屬類群定性分析 應用乳桿菌屬和雙歧桿菌屬內常見種的特異性引物（表2）對糞便菌體基因組DNA進行PCR擴增［14-16］，定性分析各目標細菌在樣品中的出現頻率。乳桿菌屬（Lactobacillus）檢測種包括L.plantarum（植物乳桿菌）、L.salivarius（唾液乳桿菌）、L.casei（干酪乳桿菌）、L.acidophilus（嗜酸乳桿菌）、L.helveticus（瑞士乳桿菌）和L.fermentum（發(fā)酵乳桿菌）；雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）檢測種包括B.longum（長雙歧桿菌）、B.animalis（動物雙歧桿菌）、B.breve（短雙歧桿菌）和B.adolescentis（青春雙歧桿菌）。擴增體系（25 μL）為：10×PCR緩沖液 2.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/μL）2 μL，引物（10 pmol/μL）各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶 （5 U/μL）0.25 μL，ddH2O補足至25 μL。反應程序為：95℃ 4 min；95℃1 min，退火30 s，72℃45 s，30個循環(huán)；72℃10 min。得到的PCR產物用1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測［14］。

表2 乳桿菌屬和雙歧桿菌屬部分種特異性引物Table2 Specific primers of Lactobacillus and Bifidobacterium Species

1.3 數據處理

1.3.1 統(tǒng)計學分析 基于Past（Hammer等，2001）軟件，使用Mann-Whitney法對城鄉(xiāng)樣本營養(yǎng)成分攝入量和腸道微生物多樣性指數進行差異顯著性分析。

1.3.2 DGGE圖譜聚類分析和PCA分析 使用Quantity One軟件對DGGE圖譜條帶去除背景強度和設定噪聲水平，自動獲得圖譜密度剖面圖，完成條帶檢測，利用條帶間相似度采用戴斯系數（Dice coefficient）計算各樣品間相似性，得到樣品相似性矩陣圖，并用UPGMA算法繪制系統(tǒng)樹狀圖，完成圖譜聚類分析；同時使用Past軟件對相似性矩陣進行PCA分析，并用Origin 7.0（Microcal，USA）繪圖軟件繪圖，得到基于PC1和PC2的賦值樣本PCA分布圖［11，17］。

1.3.3 樣品微生物群落多樣性統(tǒng)計學分析 使用多樣性指數Shannon-Weiner指數（H）、豐度（S）和均勻度（EH）等指標比較樣品的微生物多樣性［11，17］。計算公式為

公式（1）（2）（3）中，s為每條泳帶中條帶數目總和，ni為單一條帶i的峰面積，N為所有峰的總面積，Pi為特定條帶亮度相對于所有條帶總亮度的比率，Hmax是多樣性指數最大值。通過軟件自動獲得圖譜密度剖面圖并利用條帶間相似度按照上述公式進行計算。

1.3.4 DGGE條帶的序列測定 選擇DGGE圖譜中清晰的共性和特異性條帶，標記后切膠回收，測序。測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行［11］。

2 試驗結果

2.1 無錫城鄉(xiāng)居民腸道微生物PCR-DGGE指紋圖譜

對樣本通過基因組DNA提取，16S rRNA V3區(qū)PCR擴增和DGGE分析，得到樣本PCR-DGGE指紋圖譜（圖1），每一條泳道代表一位志愿者腸道菌群的DGGE指紋圖譜，不同位置的條帶代表該樣本中不同細菌的16S rDNA V3區(qū)基因片段，泳道中條帶數量越多，則說明該樣本中含有的微生物豐度越高。

圖1 城鄉(xiāng)居民腸道微生物DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE profiles of intestinal microflora for urban and rural residents

由圖1可知，各樣本含有的條帶數目不等、位置各異、亮度不同，說明無錫青年居民腸道微生物結構多樣性豐富，且存在個體差異。

2.2 基于PCR-DGGE指紋圖譜的城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性分析

DGGE指紋圖譜中，每個泳道中電泳條帶的多少直觀地反映樣本中細菌群落的多樣性，條帶的亮度反映該細菌的相對生物量，泳道中條帶越多，亮度越亮，則表示該樣本中微生物多樣性越豐富，該種屬細菌的相對數量越多。研究中，依據電泳圖譜各條帶信息，使用Quantity one軟件計算各樣本豐度（S）、均勻度（EH）和 Shannon-Weine多樣性指數（H），以綜合分析城鄉(xiāng)樣本的腸道微生物多樣性（表3）。由表3可知，各樣品均勻度相似，多樣性指數不同，豐度迥異，這個結果與DGGE圖譜的直觀觀測結果一致。城市的12號樣本豐度和多樣性指數最高，分別為44和3.628 0，表明12號志愿者腸道微生物多樣性最高；鄉(xiāng)村的7號樣本豐度和多樣性指數最低，分別為25和3.005 2，表明7號志愿者腸道微生物多樣性最低。分別對城鄉(xiāng)樣本各豐度、多樣性指數和均勻度求算術平均值，可知，城市樣本的均勻度、豐度和多樣性指數均大于鄉(xiāng)村樣本，分別為0.961 7、36.25和3.426 2，0.942 6、35.50和3.350 5。對結果進行差異顯著性分析，均無顯著性差異（P＞0.05），暗示無錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著。

表3 城鄉(xiāng)居民樣本DGGE條帶多樣性指數、豐度及均勻度Table3 Shannon-Wiener Index（H），Richness（S）and Evenness（EH）of DGGE bands for urban and rural residents

2.3 基于PCR-DGGE指紋圖譜的城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物相似性分析

基于DGGE指紋圖譜，計算各樣品間群落相似性系數可以得到各樣品細菌種類差異信息。表4為樣品間微生物群落相似性分析結果。整體而言，各樣品間的微生物群落相似性系數介于 18.5%～72.5%，系數較低，變化區(qū)間較大，說明各樣本微生物群落結構差異較大，個體差異明顯，此結果與DGGE圖譜直觀觀測結果以及多樣性分析結果一致。其中，相似性系數較高的有鄉(xiāng)村樣本的3號和6號、5號和6號，系數分別為71.6%、72.5%；城市樣本的9號和12號，14號和15號，系數分別為66.5%、60.9%。相似性系數較低的有鄉(xiāng)村的4號和城市的12號，鄉(xiāng)村的2號和城市的15號，以及鄉(xiāng)村的3號和城市的12號樣本，分別為18.5%、25.3% 和22.4%，城市樣本和鄉(xiāng)村樣本內部相似性系數較高，城鄉(xiāng)樣本間相似性系數較低，說明城市和鄉(xiāng)村青年居民內部腸道微生物群落結構相似性較高，大于城鄉(xiāng)青年居民之間。此外，表4也顯示，部分城鄉(xiāng)樣本間相似性系數也較高，如鄉(xiāng)村的8號和城市的13號樣本，鄉(xiāng)村的4號和城市的10號樣本，系數分別為64.1%、58.4%；而部分城鄉(xiāng)樣本內部相似性系數較低，如鄉(xiāng)村的2號和3號樣本，以及城市的11號和12號樣本，相似性系數為22.2%和27.7%，說明部分城鄉(xiāng)居民間腸道微生物群落結構相似性也較高，存在個體差異。

表4 城鄉(xiāng)居民腸道微生物群落結構相似性分析Table4 Similarity coefficients of microbial community of urban and rural residents %

對圖譜進行聚類分析以進一步觀察無錫青年居民腸道微生物群落結構相似性，見圖2（a），樣本共聚為4簇（族群1—4）。族群1中，城市的9號和12號樣本以約66%的相似性聚為一簇；族群2中，城市的14號和15號樣本以約60%的相似性聚為一簇；族群3中，鄉(xiāng)村的3號、5號和6號樣本以約69%的相似性聚為一簇；族群4中，城市的11號、13號和16號樣本以約40%的相似性聚為一簇。族群2（城市樣本）和族群3（鄉(xiāng)村樣本）以約35%的相似性聚為一簇，城市或鄉(xiāng)村樣本按照采集地以較高的相似性聚為一簇，城鄉(xiāng)樣本間以較低的相似性聚為一簇，說明無錫城市或鄉(xiāng)村各自青年居民內部腸道微生物群落結構相似性較高，城鄉(xiāng)間則存在差異。族群1、2和4中，鄉(xiāng)村的2號、7號、1號和8號樣本分別以約63%、53%、40%和80%的相似性與城市樣本集聚為一簇，以及族群4中，城市的10號樣本和鄉(xiāng)村的4號樣本以58%的相似性聚為一簇，部分鄉(xiāng)村樣本以一定的相似性與城市樣本集聚，暗示部分鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物群落結構與城市青年居民相似，這也提示，城鄉(xiāng)比較而言，城市居民的腸道微生物群落結構相似性更高，個體差異較小，而鄉(xiāng)村居民腸道微生物群落結構個體差異較大。

對圖譜進行PCA分析以進一步觀察樣本間的集聚趨勢，如圖2（b）所示，主成分因子PC1的貢獻率為28.07%，主成分因子PC2的貢獻率為16.45%；鄉(xiāng)村樣本集聚于圖形左側，而大部分城市樣本集聚于圖形右側，城鄉(xiāng)樣本分別集聚為一簇，并彼此分開，說明無錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物群落結構具有分開趨勢；此外，也有兩個城市樣本與鄉(xiāng)村樣本集聚為一簇的現象存在，說明部分無錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物群落結構相似。

圖2 基于DGGE指紋圖譜的聚類和PCA分析Fig.2 Analysis of cluster and PCA on DGGE profiles

相似性分析說明，居住距離較遠、生活環(huán)境不同的無錫城鄉(xiāng)青年居民間腸道微生物群落結構差異較小，相似性小于居住距離較近、生活環(huán)境相似的無錫城市或鄉(xiāng)村居民內部。

2.4 基于PCR-DGGE指紋圖譜對城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物組成的分析

DGGE指紋圖譜不僅可直觀地反映樣本細菌群落結構和多樣性，也可進一步通過切膠回收測序分析樣本細菌群落組成。研究中，選取圖譜中具有代表性的共性和特異性條帶（圖1）進行膠回收和克隆測序（表5），以分析不同人群腸道菌群組成的異同。試驗中共選取條帶32條，其中11條條帶為所有樣本共有，分別為條帶1、12—20和25，測序結果顯示分別為變形菌門 （Proteobacteria）的不動桿菌屬（Acinetobacter），變形菌綱（Alpha proteobacterium）、放 線 菌 門 （Actinobacteria） 的 雙 歧 桿 菌 屬（Bifidobacterium）；條帶2—10、21、23—24、26—29 和31—32共18條條帶是部分城鄉(xiāng)樣本共有，測序結果為變形菌門 （Proteobacteria）的不動桿菌屬（Acinetobacter）和桿菌屬菌，硬壁菌門（Firmicutes）的葡萄球菌屬 （Staphylococcus）、 乳 桿菌 屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和梭菌屬（Clostridium）；條帶11、22和30共3條條帶為僅鄉(xiāng)村樣本含有而城市樣本不含有，測序結果為桿菌屬（Bacterium）菌和變形菌門的不動桿菌屬菌。

測序結果中，絕大部分條帶的序列與GenBank數據庫中細菌的同源性大于98%，有的同源性甚至達到100%。但是條帶2、10—13、21、23—24、28和31與數據庫中最近親緣菌種間的同源性低于97%，其鑒定結果分別為不可培養(yǎng)桿菌屬細菌、長雙歧桿菌和Alpha變形菌綱細菌，因此它們所代表的細菌有可能為新的不可培養(yǎng)物種及其屬細菌的新菌種。

測序結果表明，城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物組成在門水平上相同，都含有硬壁菌門、放線菌門和變形菌門；在屬水平上沒有多樣性的差異，但是豐度和數量上存在差異，其中不動桿菌屬、雙歧桿菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、梭菌屬和瘤胃球菌屬為城鄉(xiāng)青年居民腸道內的共有菌屬。

2.5 乳桿菌屬和雙歧桿菌屬類群定性分析結果

腸道內以乳桿菌屬和雙歧桿菌屬為代表的益生乳酸菌，因其可通過代謝食物中的糖類物質生成乳酸及其它代謝物而保護腸道上皮細胞，加強腸道自身免疫系統(tǒng)功能，抵抗腸道腫瘤及炎癥等疾病，這些成了近些年食品微生物學界研究的熱點。本課題研究中使用PCR技術對乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的若干個種在無錫城鄉(xiāng)青年志愿者腸道菌群中的出現頻率進行檢測（表6）。使用瓊脂糖凝膠電泳觀察各PCR擴增產物，如果出現清晰、明亮的條帶，則擴增成功，說明該樣品中含有該目標細菌，否則則說明該樣品中不含有該目標細菌。結果顯示，乳桿菌屬細菌中的L.plantarum、L.casei和L.salivarius以及雙歧桿菌屬的B.longum和B.breve的檢出率較高，為90%左右，在無錫青年居民腸道內普遍存在；乳桿菌屬的L.acidophilus和雙歧桿菌屬的B.animalis和B.adolescentis的檢出率適中，約50%～70%，在大部分青年居民腸道內存在；L.helveticus和L.fermentum的檢出率較低，為20%左右，在部分城鄉(xiāng)青年居民腸道內存在。城鄉(xiāng)比較而言，L. plantarum、L.fermentum、L.salivarius、B.animalis、B. breve和B.longum的檢出率鄉(xiāng)村樣本高于城市樣本，L.helveticus和L.acidophilus的檢出率城市樣本高于鄉(xiāng)村樣本，L.casei和B.adolescentis的檢出率城鄉(xiāng)樣本相同。使用Mann-Whitney分析對各類菌群在城鄉(xiāng)樣本中的分布進行差異性分析，結果顯示均無顯著性。

表5 腸道菌群PCR-DGGE特征條帶序列比對結果Table5 Alignment of intestinal microflora PCR-DGGE band to its most-similar GenBank sequence

表6 城市和鄉(xiāng)村居民腸道中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬各種的定性分析Table6 Qualitative analysis of some Lactobacillus and Bifidobacterium species in intestinal tract of urban and rural residents

分析可知，L.plantarum、L.casei、L.salivarius和L.acidophilus以及B.longum、B.breve、B.animalis 和B.adolescentis分別為無錫青年居民腸道內的優(yōu)勢乳桿菌和雙歧桿菌。城鄉(xiāng)比較而言，各類群菌在居民腸道內分布差異不顯著。

3 討論

個體腸道微生物在經歷了嬰兒期的不穩(wěn)定期后，隨著個體的成長逐漸成為一個穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，這個微生態(tài)系統(tǒng)受人的基因型、性別、年齡、身體質量指數、地理環(huán)境、膳食結構，以及生活方式等因素的影響，不同個體腸道菌群組成不同［1，5］。本課題研究中，DGGE圖譜直觀觀測結果和基于圖譜的相似性分析均顯示，無錫青年居民腸道微生物群落結構存在個體差異。與本研究結果相似，Zoetendal等［18］在使用TGGE技術對不同個體腸道微生物群落研究的報道中指出，即使是生活在相同環(huán)境、具有相同飲食習慣的配偶間，腸道菌群也會顯示出較低的相似性。

盡管人體腸道微生物菌群構成個體差異較大，但研究發(fā)現不同個體間有相同的核心菌群存在［19-20］，而生活環(huán)境和飲食方式是引起核心菌群波動的主要因素［7-8］。Yatsunenko等［8］對具有西方飲食習慣的美國居民和非西方飲食習慣的非裔馬拉維及土著印第安居民的腸道菌群進行研究，結果發(fā)現美國居民與馬拉維和印第安居民的腸道微生物群落結構明顯分離，集聚為不同的簇。Zhang等［21］在使用PCRDGGE技術對保持原有生活方式和飲食習慣的錫林郭勒盟草原蒙古族居民和已趨于現代化生活方式的呼和浩特城市蒙古族居民的腸道微生物群落結構的研究中證實，城市蒙古族志愿者與草原蒙古族志愿者腸道菌群結構具有顯著差異。郭壯［22］亦使用焦磷酸測序技術對西藏藏區(qū)居民和城市藏族居民腸道微生物群落結構進行研究，結果顯示藏族城市居民樣本與藏區(qū)居民樣本腸道微生物群落結構呈現出明顯的分離現象。本研究中得到了與報道相似的結果，基于DGGE圖譜進行的相似性分析顯示，無錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物群落結構呈現分開趨勢，相似性小于城市或鄉(xiāng)村青年居民內部。不同的生活環(huán)境和生活方式使無錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物群落結構不同。

研究中，基于圖譜的多樣性分析也顯示無錫城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著，定性分析也暗示乳桿菌屬和雙歧桿菌屬各類群細菌在城鄉(xiāng)青年居民腸道內分布無顯著性差異。與本研究結果不同，Filippo等［23］報道，生活在非洲布基納法索（Burkina Faso）村莊的兒童其腸道菌群的多樣性大于意大利弗羅倫薩（Florence）的城市兒童。郭壯［22］報道，藏族城市居民腸道菌群的多樣性高于藏區(qū)牧民。近些年隨著社會的快速發(fā)展，城鄉(xiāng)差距逐漸縮小，飲食方式也日趨同化，結合居民膳食調查表進行分析發(fā)現，城鄉(xiāng)青年居民日常膳食中蛋白質、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)元素的攝入量相當，無顯著性差異。這些都足以說明無錫城鄉(xiāng)青年居民日常飲食結構已趨相似，相似的飲食習慣可能是引起城鄉(xiāng)青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著的原因。此外，本研究中，研究對象分別選自同一省市，距離較近（100 km以內），居民生活環(huán)境相似，相似的生活環(huán)境可能是引起這一結果的另一原因。

4 結語

綜上所述，無錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道微生物多樣性差異不顯著。通過DGGE技術和PCR技術相結合的方法分析無錫城市和鄉(xiāng)村青年居民腸道菌群多樣性的異同，以及對優(yōu)勢菌屬乳桿菌屬和雙歧桿菌屬各細菌種在志愿者腸道中的分布差異進行初步的分析，揭示了無錫城鄉(xiāng)青年居民的腸道微生物多樣性，為后續(xù)國內人群腸道微生物群落結構的進一步深入研究提供了先例和基礎數據。

［1］TURNBAUGH P J，LEY R E，HAMADY M，et al.The human microbiome project［J］.Nature，2007，449：804-810.

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Study on the Diversity of Intestinal Flora of Young Rural and Urban Residents in Wuxi

QIAO Jianmin， ZHANG Jiachao， ZHENG Yi， HOU Qiangchuan，HUANG Weiqiang， HUO Dongxue， GUO Zhuang， ZHANG Heping*
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The gut microbial diversity of young people living in rural and urban Wuxi was studied by the combination of polymerase chain reaction（PCR）and denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）.Based on the DGGE profile，the similarity of volunteers was performed by analysis of clustering and PCA.On the other hand，the diversity was evaluated by the Shannon-Weine index，richness and eveness.The composition of gut microbiota was further characterized by sequencing of the common and special bands of the lanes in DGGE profile.Based on the PCR，the diversity ofLactobacillus and Bifidobacterium species in the gut of rural and urban volunteers was analyzed.The results showed that the structure of gut microbiota between rural and urban residents of Wuxi appeared a separated tendency，and the similarity of intestinal flora between them was lower than that of urban or rural residents alone.Furthermore，the diversity between them were not significantly different.The genus of Acinetobacter，Bifidobacterium，Staphylococcus，Lactobacillus，Clostridium and Ruminococcus were the common bacteria in the gut of young urban and rural residents.All kinds of bacteria of Lactobacillus（L.）and Bifidobacterium（B.）in the gut were not significantly different in rural and urban residents.And the species of L.plantarum，L.casei，L.salivarius，L.acidophilus，B. longum，B.breve，B.animalis and B.adolescentis were the predominant Lactobacillus and Bifidobacterium bacteria，respectively.On the base of the above comprehensive analysis，it can be preliminarily draw a conclusion that the diversity of gut microbiota was not significantly different between the young residents from rural and urban Wuxi.

young rural and urban residents in Wuxi，microbial diversity，PCR，DGGE

Q 93-3

A

1673—1689（2016）08—0839—10

2014-12-09

農業(yè)部現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設項目（CARS-37）。

張和平（1965—），男，內蒙古四子王旗人，農學博士，教授，主要從事乳品生物技術研究。E-mail：hepingdd@vip.sina.com