唐 川， 吳 迪， 楊 焱*， 李巧珍， 劉艷芳， 周 帥， 顏夢秋

（1.國家食用菌工程技術研究中心，上海市農(nóng)業(yè)科學院 食用菌研究所，南方食用菌資源利用農(nóng)業(yè)部重點實驗室，上海201403；2.上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

猴頭菌細胞壁多糖的提取和其結構特征

唐 川1，2， 吳 迪1， 楊 焱*1， 李巧珍1， 劉艷芳1， 周 帥1， 顏夢秋1

（1.國家食用菌工程技術研究中心，上海市農(nóng)業(yè)科學院 食用菌研究所，南方食用菌資源利用農(nóng)業(yè)部重點實驗室，上海201403；2.上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院，上海200234）

以猴頭菌子實體殘渣為試驗材料，研究了殘渣粉粹時間及提取用溶劑對其細胞壁多糖提取得率和結構特征的影響。研究發(fā)現(xiàn)粉碎時間延長可增加水溶性細胞壁多糖的得率，但多糖含量會降低，粉粹時間對水溶性細胞壁多糖的絕對重均分子質(zhì)量分布及單糖組成影響較大，最佳粉碎時間為15 min。NaOH濃度的增加可提高堿溶性細胞壁多糖的得率和含量，但免疫活性降低，最適的NaOH濃度為0.5 mol/L。粉碎水提、堿提兩種方式得到的細胞壁多糖均能夠顯著刺激小鼠巨噬細胞釋放NO，具有較好的體外免疫活性；比較水溶性細胞壁多糖與堿溶性細胞壁多糖的結構差異，發(fā)現(xiàn)水溶性細胞壁多糖絕對重均分子質(zhì)量遠大于堿溶性細胞壁多糖。堿溶性細胞壁多糖只含有葡萄糖，而水溶性細胞壁多糖還含有一定量的半乳糖，且葡萄糖與半乳糖之間的摩爾比值約為4∶1。優(yōu)選獲得了猴頭菌細胞壁多糖的高效制備方法，明確了猴頭菌水溶性與堿溶性細胞壁多糖結構特征間的差異。

猴頭菌；細胞壁多糖；提取方式；結構特征；巨噬細胞

猴頭菌（Hericium erinaceus）子實體含有豐富的多糖類物質(zhì)，具有明顯的抗腫瘤、提高免疫力、降血糖、降血脂等活性，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱、胃炎及胃潰瘍等疾?。?］。目前針對猴頭菌多糖的研究和利用主要集中在水溶性胞內(nèi)多糖，相關的制備工藝已有很多報道［2-3］。同時，常規(guī)水提多糖后的猴頭菌子實體殘渣量非?？捎^，含有豐富的細胞壁多糖，這部分多糖通常沒有繼續(xù)提取利用而被丟棄［4］，其具有很大的研究開發(fā)價值。研究表明，細胞壁多糖通常是β構型的葡聚糖，可分為水溶性、堿溶性與堿不溶性葡聚糖［5］，而且多以β-1，3或β-1，6方式連接，這部分葡聚糖具有很強的免疫活性。目前細胞壁中的β-葡聚糖通常采用熱水和堿液提取，這兩種方法所得多糖具有不同的相對分子質(zhì)量及分子構象［5］，提取方法不同亦導致多糖的生理活性存在差異［6-7］?，F(xiàn)在對于酵母菌細胞壁多糖的研究較多，主要采用冷凍研磨［5］、酸堿法及高溫［8］等方法提取，而食用菌細胞壁多糖的研究較少，有關猴頭菌細胞壁多糖具體的提取工藝及結構特征尚未見報道。本文作者通過對提取完胞內(nèi)多糖的猴頭菌殘渣進行水提、堿提的部分條件優(yōu)化，研究了粉碎時間及提取溶劑對細胞壁多糖的得率、多糖含量及體外免疫活性的影響。在此基礎上，對水溶性和堿溶性細胞壁多糖的相對分子質(zhì)量及單糖組成等結構特征進行比較，明確不同提取方法對猴頭菌細胞壁多糖的影響。以期得到一種高效的猴頭菌細胞壁多糖的制備方法，為猴頭菌多糖的深度開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用新鮮的猴頭菌子實體，撕成碎塊經(jīng)沸水反復浸提至水提液基本無苯酚-硫酸反應為止，60℃烘干，再用體積分數(shù)95%的乙醇浸泡5 d，揮發(fā)干乙醇，烘干即得到猴頭菌殘渣。

葡聚糖標準品和單糖標準品，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶，Gibco公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素，Amersco公司產(chǎn)品；細菌脂多糖（1ipopolysaccharide，LPS），Sigma公司產(chǎn)品。PBS配制：含0.14 mol/L NaCl，0.004 mol/L Na2HPO4，0.002 7 mol/L KCl，0.002 mol/L KH2PO4，調(diào)pH至7.4，用蒸餾水定容至 1 L，備用。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。RAW264.7細胞株（小鼠巨 噬 細 胞 株）：ATCC （American Type Culture Collection），編號SC2150。

1.2 儀器與設備

DJ-10A中藥粉碎機，上海淀久中藥機械制造有限公司制造；Synergy HT酶標儀，Bio-TEK公司制造；R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI公司制造；Allegra 25R Centrifuge離心機，Beckman公司制造；Waters e2695型高效液相系統(tǒng)，Waters公司制造；八角度激光光散射儀及黏度檢測器，Wyatt公司制造；ICS2500型離子色譜儀，Dionex公司制造。

1.3 猴頭菌細胞壁多糖提取方式的確定

1.3.1 粉碎水提細胞壁多糖的條件優(yōu)化 分別稱取30 g粉碎不同時間（5、10、15、20、30 min）的猴頭菌殘渣粉末，參照文獻［9］提取條件，即以料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，100℃提取2 h，2次，過濾，合并濾液，15 317 g離心15 min，得到猴頭菌多糖提取液。提取液按濃縮比（子實體干質(zhì)量∶粗提液體積（g/mL））1∶5濃縮，加入一定量的乙醇，使乙醇體積分數(shù)達到70%，4℃靜置12 h，15 317 g離心15 min，收集沉淀，蒸餾水溶解，透析后（3 500 Da，3 d）凍干，即獲得水溶性細胞壁多糖，依粉碎時間的不同依次命名為 HPCW5、HPCW10、HPCW15、HPCW20、HPCW30，對照組為水提的胞內(nèi)多糖HPW。

1.3.2 堿提細胞壁多糖的條件優(yōu)化 稱取30 g粉碎15 min的水提胞壁多糖后的猴頭菌殘渣，以料液比1∶20（g/mL）加入不同濃度的（0.1、0.5、1 mol/L）NaOH溶液，參照文獻［10］選擇4℃浸提2 h，2次，過濾，15 317 g離心15 min，得到猴頭菌多糖提取液。提取液用6 mol/L鹽酸低溫中和，按濃縮比1∶5濃縮，加入一定量的乙醇使乙醇體積分數(shù)達到70%，4℃靜置12 h，15 317 g離心15 min，收集沉淀，蒸餾水溶解，透析后（3 500 Da，3 d）凍干，即獲得堿溶性細胞壁多糖，依堿濃度由低到高分別命名為HPCB0.1、HPCB0.5、HPCB1。

1.3.3 水溶性與堿溶性細胞壁多糖的制備 在最優(yōu)的粉碎時間下，按1.3.1的方法得到水溶性猴頭菌細胞壁多糖；粉碎水提后的殘渣再在最佳的堿濃度下，按1.3.2的方法得到堿溶性猴頭菌細胞壁多糖。

1.4 分析方法

1.4.1 粗多糖的多糖得率和多糖含量測定

式（1）中：r為多糖得率，mc為粗多糖的質(zhì)量（g），mz為子實體殘渣的質(zhì)量（g）。

以D-葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定多糖組分中的多糖含量［11］。

1.4.2 HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用分析多糖相對分子質(zhì)量分布 采用Waters 2695型高效液相系統(tǒng)配TSK PWXL6000型與TSK PWXL4000型串聯(lián)色譜柱，以及2414型示差折光檢測器；以DAWN8+型激光檢測器分析粗多糖的相對分子質(zhì)量分布。參照文獻［12］，選取流動相為0.15 mol/L NaNO3和0.05 mol/L NaH2PO4·2H2O溶液（pH 7.0，含質(zhì)量分數(shù)0.02%疊氮鈉），濃度為0.5 mol/L，恒定色譜柱溫為35℃，激光檢測器光源波長選用623.8 nm，多糖在溶液中的折光指數(shù)增量（dn/dc）按照0.146 mL/g計算。用流動相將粗多糖配成3 mg/mL溶液，12 000 g離心20 min后取上清液，進行HPSEC-MALLS-RI分析。最后使用Astra（version 6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA）數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進行采集和分析，計算相對分子質(zhì)量。

1.4.3 單糖組成分析 采用高效陰離子交換色譜法測定猴頭菌細胞壁多糖的單糖組成，取2 mg多糖樣品加入2 mol/L的三氟乙酸 （TFA）3 mL，在110℃油浴中水解4 h。水解后用氮吹儀吹干，并多次加入甲醇，反復吹干至無酸味即可。水解產(chǎn)物用超純水溶解，離心，稀釋后以離子色譜測定水解產(chǎn)物中的單糖組成。

1）標準品：D-Gal、D-Glc、D-Ara、L-Fuc、L-Rha、D-Man、D-Xyl、D-Fru、Rib、D-GluA和D-GalA混標。

2）色譜條件：CarboPac PA-20陰離子交換柱（150 mm×3 mm i.d.），進樣量25 μL，體積流量0.45 mL/min，柱溫 30℃，流動相為超純水和0.25 mol/L的NaOH［13］。

1.4.4 體外刺激巨噬細胞釋放NO的活性 稱取一定量的猴頭菌細胞壁多糖樣品，在無菌條件下用PBS配成6 mg/mL的溶液，12 000 g離心30 min，于無菌操作臺將上清液轉(zhuǎn)入滅菌管中，再用PBS將樣品稀釋至不同作用濃度，參照文獻［14］測定巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO的產(chǎn)量。

2 結果與分析

2.1 粉碎時間對水提的猴頭菌細胞壁多糖的影響

2.1.1 多糖得率及含量 對經(jīng)多次提取已檢測不出提取液中多糖存在的猴頭菌殘渣進行不同時間粉碎后，按1.3.1方法進行再次提取，制備水溶性細胞壁多糖。由圖1可知，粉碎有助于細胞壁多糖的溶出，隨著粉碎時間的延長，多糖得率呈增大趨勢，粉碎15 min后增長趨勢有所降低；而多糖質(zhì)量分數(shù)呈降低趨勢，在30 min時達到最低為62.44%。

圖1 水提猴頭菌細胞壁多糖得率及質(zhì)量分數(shù)Fig.1 Yields and contents of cell wall polysaccharides by water extraction from Hericium erinaceus fruit bodies

2.1.2 相對分子質(zhì)量分布 采用HPSEC-MALLSRI聯(lián)用對水提的猴頭菌細胞壁多糖進行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)粉碎不同時間的猴頭菌，經(jīng)沸水提取的細胞壁多糖峰形差異較大（圖2）。高效液相圖譜主要含有3個峰，峰1的重均分子質(zhì)量在1.0×107～3.0×107g/mol之間，峰2的重均分子質(zhì)量在3.0×106g/mol左右，峰3的重均分子質(zhì)量在2.0×105～9.0×105g/mol，進一步表明猴頭菌水溶性細胞壁多糖為大分子多糖，重均分子質(zhì)量均大于2.0×105g/mol。而對照組水提的胞內(nèi)多糖 （HPW），重均分子質(zhì)量主要集中在5.0×104g/mol，可以看到猴頭菌水溶性細胞壁多糖的重均分子質(zhì)量遠大于胞內(nèi)多糖。在0～10 min隨著粉碎時間的延長，峰1所占的比例呈增大趨勢，即大分子量多糖增多；當粉碎時間達到15 min以后，細胞壁多糖的相對分子質(zhì)量（M=Mrg/mol）分布無顯著差異。

圖2 水提的猴頭菌細胞壁多糖的高效液相圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of cell wall polysaccharides by water extraction from Hericium erinaceus fruit bodies

2.1.3 單糖組成 對粉碎不同時間后水提的猴頭菌細胞壁多糖進行酸水解，結果發(fā)現(xiàn)不同粉碎時間沸水提取的細胞壁多糖的單糖組成差異較大（表1）。水提的猴頭菌細胞壁多糖主要由半乳糖、葡萄糖組成，并含有巖藻糖及葡萄糖醛酸。與對照組胞內(nèi)多糖比較，粉碎水提的細胞壁多糖中葡萄糖與半乳糖的比率明顯降低。隨著粉碎時間的延長，半乳糖與葡萄糖之間的摩爾比差異不明顯，在1∶4～1∶6。其中水溶性猴頭菌細胞壁多糖含有較多的半乳糖，這與胞內(nèi)多糖相差明顯，且與以往報道的細胞壁多糖主要是由葡聚糖組成有所不同。

2.1.4 刺激巨噬細胞釋放NO的產(chǎn)量 對粉碎不同時間后沸水提取的猴頭菌細胞壁多糖進行體外刺激巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO的試驗結果表明（圖3），粉碎不同時間后水提的細胞壁多糖均具有較好的刺激巨噬細胞的活性。隨著粉碎時間的延長，體外免疫活性有所降低，粉碎時間15 min后，體外免疫活性差異不明顯。

表1 水提的猴頭菌細胞壁多糖的單糖組成及摩爾比Table1 Mole ratios of monosaccharide of cell wall polysaccharides by water extraction from Hericium erinaceus fruit bodies

比較粉碎不同時間水提的細胞壁多糖得率、多糖質(zhì)量分數(shù)、相對分子質(zhì)量分布等理化性質(zhì)及體外免疫活性，綜合考慮經(jīng)濟因素，選擇最優(yōu)粉碎時間15 min，此時細胞壁多糖得率及多糖質(zhì)量分數(shù)分別達到3.16%和67.88%。

圖3 水提的猴頭菌細胞壁多糖對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響Fig.3 Effect of cell wall polysaccharides by water extraction from Hericium erinaceus fruit bodies on the NO release by RAW264.7 macrophages

2.2 NaOH濃度對堿提細胞壁多糖的影響

2.2.1 多糖得率及多糖質(zhì)量分數(shù) 采用不同濃度的NaOH對水提取細胞壁多糖的粉碎殘渣繼續(xù)提取，由表2可知，NaOH濃度對堿提的細胞壁多糖得率及多糖質(zhì)量分數(shù)影響顯著，隨著NaOH濃度的增加，多糖得率及多糖質(zhì)量分數(shù)均呈增大趨勢，但當NaOH濃度從0.5 mol/L上升至1 mol/L時多糖質(zhì)量分數(shù)上升幅度很小，趨于穩(wěn)定。

表2 堿提猴頭菌細胞壁多糖得率及多糖質(zhì)量分數(shù)Table2 Yields and contents of cell wall polysaccharides by alkaline extraction from Hericium erinaceus fruit bodies

2.2.2 刺激巨噬細胞釋放NO的產(chǎn)量 對不同NaOH濃度提取的猴頭菌細胞壁多糖刺激巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO的比較研究發(fā)現(xiàn)（圖4），堿提的細胞壁多糖也表現(xiàn)出較好的體外免疫活性，但隨著NaOH濃度的增加，體外刺激巨噬細胞的活性呈降低趨勢，尤其NaOH濃度在1 mol/L時活性下降了50%以上，可能原因是高濃度的NaOH破壞了細胞壁多糖的結構，使其免疫活性降低。綜合考慮多糖得率、多糖含量及體外免疫活性等指標，選擇使用0.5 mol/L NaOH提取猴頭菌細胞壁多糖，此濃度下提取的多糖不僅具有很好的體外免疫活性，同時多糖質(zhì)量分數(shù)也較高，達到64.35%。

2.3 水溶性細胞壁多糖與堿溶性細胞壁多糖結構特征比較

目前提取細胞壁多糖的方法主要采用直接堿液提取或粉碎后堿液提取，得到的細胞壁多糖基本都是堿溶性的，水溶性細胞壁多糖的提取有所忽略，使得細胞壁多糖的研究不夠全面。故研究中先對猴頭菌殘渣粉碎15 min，沸水提取水溶性細胞壁多糖，水提后殘渣再通過0.5 mol/L NaOH溶液提取堿溶性細胞壁多糖。多糖的得率及多糖質(zhì)量分數(shù)分別到達3.16%、67.88%和2.54%和64.35%。

圖4 堿提的猴頭菌細胞壁多糖對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響Fig.4 Effect of cell wall polysaccharides by alkaline extraction from Hericium erinaceus fruit bodies on the NO release by RAW264.7 macrophages

對水溶性及堿溶性的猴頭菌細胞壁多糖的相對分子質(zhì)量分布（圖5（a））、單糖組成（圖5（b））等結構特征進行研究，發(fā)現(xiàn)它們有較大的差異。高效液相圖譜分析結果表明，水溶性細胞壁多糖，主要含有 3個峰，重均分子質(zhì)量分別為 2.190×107、2.843×106、6.516×105g/mol；堿溶性細胞壁多糖，也含有 3個峰，重均分子質(zhì)量分別為 2.976×106、4.658×105、1.262×105g/mol，表明細胞壁多糖的相對分子質(zhì)量均大于10萬。同時可以看到，水溶性與堿溶性的細胞壁多糖的HPLC圖譜3個峰出峰時間相差不大，但重均分子質(zhì)量大小差異顯著，表明兩種方法提取的細胞壁多糖的分子構象存在很大差異［15］，可能與Leung M Y K報道的水溶性β-葡聚糖為三股螺旋結構，堿液提取破壞了三股螺旋結構，使β-葡聚糖變?yōu)閱喂陕菪驘o規(guī)則卷曲結構有關［16］。單糖組成分析表明，水溶性細胞壁多糖為雜多糖，主要由葡萄糖、半乳糖組成，兩者間物質(zhì)的量比值約為4∶1；堿溶性細胞壁多糖為葡聚糖，這與以往報道的細胞壁多糖為葡聚糖結果一致。

圖5 猴頭菌水溶性與堿溶性細胞壁多糖的液相圖譜及高效陰離子色譜圖Fig.5 HPLC and HPAEC chromatograms of watersoluble and alkaline-soluble cell wall polysaccharides from Hericium erinaceus fruit bodies

3 結語

研究了粉碎時間對水提的細胞壁多糖和NaOH濃度對堿提的細胞壁多糖的多糖得率、含量、理化特征及體外免疫活性的影響。結果表明，最佳的粉碎時間為15 min，最適的NaOH濃度為0.5 mol/L。在此基礎上，對水溶性細胞壁多糖與堿溶性細胞壁多糖的結構特征進行比較，發(fā)現(xiàn)水溶性細胞壁多糖主要由半乳糖、葡萄糖組成，堿溶性細胞壁多糖只含葡萄糖，且兩者具有不同的分子構象。結果進一步表明，水溶性及堿溶性細胞壁多糖均具有較好的體外刺激巨噬細胞釋放NO的活性。故對于猴頭菌細胞壁多糖的提取可以采用粉碎水提及水提殘渣再堿提的方法進行深入提取，所得多糖具有得率高、多糖含量高及生物活性好的特點。

目前很少有水溶性細胞壁多糖的相關報道，Leung M Y K制備了金針菇水溶性細胞壁活性多糖，但其預處理相對復雜［16］。通過對猴頭菌殘渣采用粉碎水提的方法制備水溶性細胞壁多糖，隨著粉碎時間的延長，水溶性細胞壁多糖的凈得率呈增大趨勢，且較大相對分子質(zhì)量多糖增多，粉碎使得細胞壁破壞，有助于細胞壁多糖的提取。對于粉碎水提后的殘渣再通過堿提的方法來制備堿溶性細胞壁多糖，該方法有別于通常采用的殘渣直接用堿提取細胞壁多糖［4］，它將水溶性與堿溶性細胞壁多糖明確區(qū)分開來。故而通過粉碎水提、水提后再堿提的方法，可以充分提取猴頭菌中的細胞壁多糖，為細胞壁多糖的深度開發(fā)，提供了一定的理論基礎。

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Extraction and Structural Characteristics of Cell Wall Polysaccharides from Hericium erinaceus

TANG Chuan1，2， WU Di1，， YANG Yan*1LI Qiaozhen1， LIU Yanfang1， ZHOU Shuai1， YAN Mengqiu1
（1.National Engineering Research Center of Edible Fungi，Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Resources and Utilization of Edible Fungi（South），Ministry of Agriculture，Shanghai201403，China； 2.College ofLife and EnvironmentalSciences，ShanghaiNormal University，Shanghai 200234，China）

Effects of pulverizing time and extraction solvents on yields and structural characteristics of cell wall polysaccharides from Hericium erinaceus residue were studied.Results showed that the yields of water-soluble cell wall polysaccharides increased but the polysaccharide contents decreased with the prolonged pulverizing time.The pulverizing time also had significant effects on the molecular distribution pattern and the monosaccharide composition of polysaccharides，and the optimal time was 15 min.The increase of NaOH concentration raised the yields and contents but reduced the immune activities of alkali-soluble cell wall polysaccharides，and the optimal NaOHconcentration was 0.5 mol/L.Both water-and alkaline-soluble polysaccharides significantly stimulated murine macrophages to release NO，indicating a potent immune activity in vitro.But the molecular weights of water-soluble cell wall polysaccharides were much larger than those of alkali-soluble ones.The later contained glucose only，while the former also contained a certain amount of galactose and the ratio of glucose to galactose was approximately 4∶1.This study established a method to obtain cell wall polysaccharide from Hericium erinaceus，and elucidated the structural difference between water-and alkali-soluble cell wall polysaccharides.

Hericium erinaceus，cell wall polysaccharide，extraction method，structural properties，macrophages

Q 539；R 284.2

A

1673—1689（2016）08—0871—07

2014-12-07

上海市農(nóng)業(yè)科學院青年科技基金項目（滬農(nóng)青年科技2012（04））。

楊 焱（1970—），女，新疆烏魯木齊人，工學博士，研究員，主要從事食藥用菌活性成分的分離純化及功能產(chǎn)品的開發(fā)研究。

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