曹慧萍， 鄭 璞*， 唐云平， 徐志南

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.浙江大學 化學工程與生物工程學院，浙江 杭州310013）

谷氨酸棒桿菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表達及固定化

曹慧萍1， 鄭 璞*1， 唐云平2， 徐志南2

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.浙江大學 化學工程與生物工程學院，浙江 杭州310013）

對谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）來源的谷氨酰胺合成酶進行腺苷?；稽c定點突變，并在大腸桿菌中進行異源表達，得到的重組酶活為6.215 U/mg。分離純化重組突變酶后，對其固定化條件及固定化酶的性質(zhì)進行研究。結果得到固定化條件為：以LX-1000EP樹脂作為固定載體，載體量0.176 g/U、pH值8.0、溫度30℃、吸附時間16 h。固定化酶活力達到3.658 U/g，酶活回收率達到67.17%。重組酶固定化后，反應最適溫度沒有變化，最適pH略向堿性偏移，儲藏穩(wěn)定性提高，轉(zhuǎn)化谷氨酸生產(chǎn)谷氨酰胺的水平與游離酶相當，對50 mmol/L谷氨酸的轉(zhuǎn)化率為92.83%，為酶法生產(chǎn)谷氨酰胺后續(xù)研究提供了參考。

重組谷氨酰胺合成酶，克隆表達，固定化，生物轉(zhuǎn)化

谷氨酰胺合成酶 （glutamine synthetase，EC 6.3.1.2）催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺，同時消耗ATP。其生理功能主要是參與氮的同化和谷氨酰胺形成，為生物體合成多種氨基酸提供氮源，運輸多余的銨離子。谷氨酰胺合成酶（GS）是生物體氮代謝的關鍵酶之一［1］。在體外，GS還用于酶促反應生產(chǎn)L-谷氨酰胺 （L-glutamine，L-Gln）和茶氨酸（N-ethyl-γ-L-glutamine）［2］。Tochikura［3］等最早提出用GS酶法生產(chǎn)L-Gln。1984年，Cardner等克隆了枯草芽孢桿菌（B.subtilis）中的GS基因glnA，并在大腸桿菌中進行了表達。GS酶法合成谷氨酰胺反應過程中需要ATP參與。Wakisaka等［4］利用谷氨酸棒桿菌來源的GS與酵母偶聯(lián)，解決了谷氨酰胺合成酶ATP循環(huán)再生的問題，最后谷氨酰胺的產(chǎn)量可達54 g/L。在國內(nèi)，酶法合成谷氨酰胺的研究日益增多，山東大學楊春玉等［5］從谷氨酸棒桿菌中提取了GS，并利用粗酶液轉(zhuǎn)化谷氨酸合成谷氨酰胺，谷氨酰胺產(chǎn)量為7.1 g/L，谷氨酸轉(zhuǎn)化率為94.8%。賁培玲等［6］在大腸桿菌中異源表達了來源于枯草芽孢桿菌的GS，并將提取的酶液與酵母耦聯(lián)，利用該轉(zhuǎn)化體系，谷氨酰胺產(chǎn)量達到27.6 g/L，谷氨酸轉(zhuǎn)化率為94.5%。由于高濃度的NH4+會促進GS的腺苷?；揎棾潭仍鰪?，從而導致GS活性降低甚至喪失，因此黃星等［7］將谷氨酸棒桿菌中的glnA基因進行定點突變，將GS上的腺苷?；稽cTyr405突變?yōu)镻he405，酶活提高了5倍，谷氨酰胺產(chǎn)量達到34.2 g/L。但利用GS酶法轉(zhuǎn)化生成谷氨酰胺的水平總體比較低，游離的GS存在容易失活的現(xiàn)象［8］。游離酶在應用過程中存在穩(wěn)定性差、易失活、酶與底物難以分離，不利于產(chǎn)物的回收與連續(xù)生產(chǎn)等缺點。

本文作者對來源于谷氨酸棒桿菌ATCC13761 的GS基因進行腺苷?；稽c的定點突變和克隆表達，并對重組突變酶（簡稱GS’）的固定化進行嘗試［9］，以期為酶法生產(chǎn)谷氨酰胺提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基 E.coli Rosetta（DE3），E.coli DH5α，谷氨酸棒桿菌 ATCC13761（C.glutamicum ATCC13761），質(zhì)粒pET-28a（+），由作者所在實驗室保存；LB培養(yǎng)基 （g/dL）：蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 1.0；pH 7.0。

1.1.2 酶、引物和主要試劑 擴增GS基因glnA的引物（見表1）和全質(zhì)粒定點突變引物（見表2），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。表1中上、下游引物分別加入NcoⅠ和HindⅢ酶切位點（下劃線標示），表2中加入定點突變位點（下劃線標示）。限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ，Taq聚合酶，T4 DNA連接酶，甲基化酶DpnⅠ等分子生物學工具酶，購自大連TaKaRa公司。細菌基因組DNA提取試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。LX-1000HA樹脂，LX-1000EP樹脂，西安藍曉科技有限公司產(chǎn)品。其他化學試劑均為進口或者國產(chǎn)分析純試劑。

表1 克隆目的基因glnA的引物Table1 Primers for cloning of the target gene

表2 全質(zhì)粒定點突變glnA（Tyr405-Phe405）的引物Table2 Primers for site-directed mutagenesis of the target gene

1.2 方法

1.2.1 GS基因的克隆及表達載體的構建 利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取谷氨酸棒桿菌ATCC13761基因組DNA，以該基因組DNA為模板，用表1中的F1和R1引物通過PCR擴增獲得GS基因glnA。對PCR片段及載體pET28a（+）進行NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，用T4 DNA連接酶于16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中。轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素50 μg/mL的LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，37℃培養(yǎng)12～16 h后提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pET28a（+）-glnA經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定并送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序分析。

1.2.2 GS基因的定點突變 以重組質(zhì)粒pET28a （+）-glnA為模板，用表2中的F2和R2引物通過PCR擴增全質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物經(jīng)甲基化酶DpnⅠ處理去除原來的模板，處理后的產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒回收后，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素50 μg/mL的LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子，37℃培養(yǎng)12～16 h后提取質(zhì)粒，獲得突變質(zhì)粒pET28a（+）-glnA’并進行測序分析。

1.2.3 GS和GS’在大腸桿菌中的表達及 SDSPAGE分析 將重組質(zhì)粒 pET28a（+）-glnA和pET28a（+）-glnA’分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Rosetta （DE3）感受態(tài)細胞中，獲得重組菌E.coli Rosetta （DE3）/pET28a（+）-glnA和E.coli Rosetta（DE3）/ pET28a（+）-glnA’，將重組菌接種至LB培養(yǎng)基（50 μg/mL卡那霉素，34 μg/mL氯霉素）中，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8左右，添加IPTG至終濃度為0.05 mmol/L，并于25℃進行誘導表達6～8 h。收集發(fā)酵液并于8 000 r/min離心10 min，菌體用預冷的0.1 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液重懸后進行超聲波破碎 （工作5 s，停7 s，40個循環(huán)，功率200 W），破碎液于10 000 r/min離心10 min，上清部分即為粗酶液。12 g/dL SDS-PAGE分析檢測重組蛋白質(zhì)表達情況。

1.2.4 重組蛋白質(zhì)的純化 收集經(jīng)誘導表達的菌體，超聲波破碎收集上清液。參照文獻［10］的方法用鎳柱純化，并測定酶活。

1.2.5 GS’酶活的測定 按Spafio［11］方法測定谷氨酰胺合成酶的γ-谷氨?；D(zhuǎn)移活性。定義在反應條件下，每分鐘催化形成1 μmol/L γ-谷氨酰羥肟酸所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

式（1）中，R為回收率，ei為固定化酶的總酶活，Ei為用于固定的酶液的總酶活。

1.2.6 固定化材料的選擇 在50 mL的錐形瓶裝入10 mL稀釋酶液（1.137 U/mL），分別加入等量的3 g LX-1000HA、殼聚糖微球、LX-1000EP，于25℃恒溫振蕩器中160 r/min振蕩16 h，過濾得到固定化酶并用蒸餾水洗滌3次，晾干，測定固定化酶活和酶活回收率。

1.2.7 固定化條件的單因素實驗 取5.683 U/mL的酶液2 mL置于50 mL的錐形瓶中，分別進行固定的載體用量（0.5～5.0 g）、溫度（15～37℃）、緩沖液pH（6.5～9.0）和固定時間的單因素試驗，反應體積10 mL。

1.2.8 溫度和最適pH對固定化GS’的影響 將固定化酶和游離酶于 20、25、30、37、40、45、50、55、60℃下測定酶液活性，以所測的不同反應溫度下最高酶活為100%，考查不同溫度對固定化谷氨酰胺合成酶活性的影響。在pH為3.0～10.0（0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液pH 3.0～7.0，0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液pH 6.5～9.0，0.1 mol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液pH 7.5～10.0）的緩沖液中，測定固定化酶和游離酶活性，以所測的不同反應pH下最高酶活為100%，考查不同pH對固定化谷氨酰胺合成酶的影響。

1.2.9 固定化GS’的穩(wěn)定性 將游離GS’和固定化GS’分別放入4℃和37℃的恒溫箱中，定時取樣測量這兩種酶的酶活。

1.2.10 固定化谷氨酰胺合成酶催化合成谷氨酰胺在5 mL反應液中加入2 g的固定化GS’，于37℃恒溫水浴鍋中反應20 h，定時取樣檢測谷氨酸含量。反應液組成為 50～200 mmol/L谷氨酸鈉，50～200 mmol/L氯化銨，50～200 mmol/L ATP和40 mmol/L氯化鎂［5］。

2 結果與分析

2.1 GS的腺苷酰化位點定點突變及其表達

2.1.1 重組蛋白質(zhì)GS和GS’在大腸桿菌中的表達源于谷氨酸棒桿菌的GS存在腺苷共價修飾，而腺苷酰化會使GS的活性降低或喪失，將GS的Tyr405定點突變?yōu)镻he405，可以去除腺苷?；稽c［7］。以谷氨酸棒桿菌 ATCC13761基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得目的基因glnA（1 460 bp），重組質(zhì)粒pET28a（+）-glnA經(jīng)酶切驗證表明構建成功，見圖1 （a），測序表明與GenBank 3345165序列一致。以質(zhì)粒pET28a（+）-glnA為模板，進行全質(zhì)粒定點突變，經(jīng)過質(zhì)粒PCR驗證，見圖1（b），再送上海生工公司測序，經(jīng)過分子生物學軟件分析，所得glnA’基因序列與NCBI上已有的C.glutamicum ATCC13761的glnA基因序列有很高的同源性，通過分析其核苷酸序列，擴增出的基因glnA’在Tyr405位點突變?yōu)镻he405位點，與黃星等［7］的報道一致。重組菌E.coli Rosetta（DE3）/pET28a（+）-glnA和 E.coli Rosetta （DE3）/pET28a（+）-glnA’經(jīng)誘導表達，SDS-PAGE蛋白質(zhì)分析，結果如圖2所示。泳道1、2在45～66 kDa處有明顯條帶，說明glnA和glnA’基因已經(jīng)表達。測定glnA表達的蛋白質(zhì)GS酶活為1.261U/mg，glnA’表達的蛋白質(zhì)GS’酶活為6.215 U/mg，定點突變后，重組菌表達蛋白質(zhì)的酶活提高了4.929倍。

圖1 重組質(zhì)粒酶切pET28a（+）-glnA和PCR質(zhì)粒pET28a （+）-glnA’鑒定Fig.1 Agarose gelelectrophoresis ofrecombinant pET28a （+）-glnA by enzyme digestion and pET28a（+）-glnA’by PCR

圖2 glnA和glnA’表達電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE of GS and GS’expression

2.1.2 重組蛋白質(zhì)的純化 經(jīng)過誘導的重組E.coli Rosetta（DE3）/pET28a（+）-glnA’細胞破碎液上清液經(jīng)過鎳柱親和層析，得到活性組分，用SDS-PAGE電泳分析純化效果，如圖3所示。重組的GS’經(jīng)鎳柱親和層析后能獲得單一蛋白質(zhì)條帶，純化后得到酶液比酶活為26.4 U/mg，純化前的細胞破碎上清液的比酶活為6.861 U/mg，蛋白質(zhì)純化倍數(shù)3.85倍。

圖3 純化后GS’的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified GS’

2.2 重組GS’的固定化

2.2.1 固定化材料的選擇 分別用LX-1000HA樹脂、LX-1000EP樹脂、殼聚糖微球?qū)S’進行固定化，結果如表3所示。3種固定化材料中LX-1000EP樹脂固定化的效果最好。選取LX-1000EP樹脂作為固定化材料，進行固定條件的確定。

表3 3種載體固定化GS’的活力比較Table3 Compare of the GS’enzyme activity in three kinds of carries

2.2.2 GS’的固定化條件優(yōu)化 溫度增加會適當促進載體對于蛋白質(zhì)的吸附，但溫度過高又會使酶蛋白質(zhì)易變性失活。圖4（a）反映了溫度對GS’固定化的影響，隨著溫度的升高，固定化GS’酶活和酶活回收率表現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，當溫度為30℃時，酶活回收率以及固定化酶活力達到最高，分別為44.63%和2.214 U/g。在過酸或者過堿的環(huán)境下，GS’容易失活，圖4（b）反映了固定化環(huán)境 pH對GS’的影響，隨著pH增加，固定化GS’酶活和固定化酶活回收率也顯示出先增后減的趨勢，當pH 8.0時，分別達到最大為2.418 U/g和48.78%。載體用量單因素試驗（圖4（c））表明，固定化酶活隨載體用量的遞增而呈現(xiàn)出先平緩后降的趨勢，酶活回收率呈現(xiàn)先增后減的趨勢，對于1.137 U/mL的酶液，在載體用量為2.0 g時，固定化酶活和酶活回收率分別達到最大，為3.672 U/g和67.17%。酶固定化時間曲線如圖4（d）所示，固定化酶活隨時間的延長而逐步增加，在16 h固定化酶活達到最高3.658 U/g，此后固定化酶活相對穩(wěn)定，說明載體吸附的酶量達到飽和，再延長時間也不提高酶活。GS’的固定化條件為：1 U酶液載體用量 0.176 g，固定化溫度30℃，pH 8.0，時間16 h。

圖4 固定化條件對GS’固定化的影響Fig.4 Effect of conditions for immobilization on activity of immobilzed enzyme

2.3 固定化GS’的性質(zhì)

2.3.1 固定化GS’最適反應溫度與pH值 考察固定化谷氨酰胺合成酶的最適反應溫度。如圖5所示，在20～45℃下隨著溫度的升高，酶活也逐漸升高；當溫度高于 45℃，酶活開始下降，故最適反應溫度為45℃。相比于游離GS’，固定化GS’的最適溫度沒有變化。在最適反應溫度下，考察固定化谷氨酰胺合成酶的最適反應pH。由圖6可知，固定化谷氨酰胺合成酶活性隨pH的升高而升高，pH為8.0時酶活最高，即為最適反應pH；pH大于8.0，酶活逐漸降低，該固定化酶較適合在偏堿的環(huán)境中進行反應，在偏酸的環(huán)境中酶活容易喪失。相比于游離酶，固定化GS’的最適合pH發(fā)生了偏移。

圖5 溫度對游離酶和固定化酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on the free enzyme and immobilized enzyme activity

圖6 反應pH對游離酶和固定化酶的影響Fig.6 Effect of buffer pH value on the free enzyme and immobilized enzyme activity

2.3.2 固定化GS’的穩(wěn)定性 比較固定化GS’與游離GS’在4℃和37℃的穩(wěn)定性，如圖7（a）和圖7 （b）所示，固定化GS’的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離GS’。在4℃保存一個月，固定化GS’剩余酶活為82.35%，而游離GS’酶活只有46.26%；在37℃下放置一周，固定化GS’剩余酶活為40.63%，而游離GS’酶活只有6.59%。說明谷氨酰胺合成酶利用LX1000-EP樹脂固定后，其穩(wěn)定性有顯著提高。

圖7 固定化酶與游離酶的穩(wěn)定比較Fig.7 Stability of the immobilized enzyme and free enzyme

2.3.3 固定化GS’酶法轉(zhuǎn)化谷氨酰胺 固定化操作會對酶的催化性能產(chǎn)生影響，比較固定化GS’和游離GS’轉(zhuǎn)化谷氨酸產(chǎn)谷氨酰胺的情況。如圖8所示，固定化GS’與游離GS’的谷氨酸轉(zhuǎn)化率皆隨著底物濃度的升高而逐漸下降，并且通過比較可以看出兩者轉(zhuǎn)化規(guī)律一致，表明LX-1000EP樹脂制備的固定化GS’可轉(zhuǎn)化谷氨酸生成谷氨酰胺，且在低濃度底物的情況下，轉(zhuǎn)化率較高。反應生成ADP對谷氨酰胺合成酶產(chǎn)生抑制［10］，無法將更多的谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺。當?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時，轉(zhuǎn)化效果最好，固定化GS’在2 h反應趨于平衡，20 h轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化率達到92.83%，谷氨酰胺的產(chǎn)量達到6.71 g/L。對于50 mmol/L谷氨酸進行固定化GS’反復利用轉(zhuǎn)化實驗，前5次谷氨酸轉(zhuǎn)化率分別為 92.64%、93.73%、92.94%、93.31%和92.28%以上，第6次時因為酶活降低而只達到83.07%。說明該固定化酶具有回收再利用的可能性。

圖8 反應時間對谷氨酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of reaction time on conversion of GA

3 結語

從谷氨酸棒桿菌中克隆谷氨酰胺合成酶，并對該酶進行了定點突變，在大腸桿菌中進行誘導表達。選用LX-1000EP樹脂固定化GS’，確定固定化條件為：對1 U酶液，載體用量0.176 g，固定化溫度30℃，pH 8.0，吸附時間16 h，在此條件下固定化酶活達到3.658 U/g，酶活回收率達67.17%。固定化GS’的最適pH較游離酶發(fā)生偏移，儲藏穩(wěn)定性明顯提高。固定化GS’轉(zhuǎn)化50 mmol/L谷氨酸產(chǎn)谷氨酰胺6.71 g/L，轉(zhuǎn)化率為92.83%。本文所述的固定化酶轉(zhuǎn)化反應只是在低濃度底物條件下進行，后續(xù)利用外源ATP再生系統(tǒng)，并對轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，提高底物濃度，有望提高產(chǎn)物谷氨酰胺的濃度。

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Cloning，Expression and Immobilization of Glutamine Synthetase from Corynebacterium glutamicum

CAO Huiping1， ZHENG Pu*1， TANG Yunping2， XU Zhinan1
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.College of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310031，China）

The glutamine synthetase encoded gene of Corynebacterium glutamicum was cloned and mutated on polyadenylation sites，followed by heterogeneous expression in E.coli with high enzyme activity of 6.215 U/mg.The recombinant mutant enzyme（GS'）was purified，and LX1000-EP resin was employed as the immobilization carrier.The results showed that the optimal conditions for immobilization were in the following：0.176 g carriers/1 U enzyme，pH 8.0，25℃and 16 h.Under the above conditions the highest bioactivity（3.658 U/g）of immobilized GS'was achieved with high active recovery rate of 67.17%.Compared with free enzyme，the immobilized GS has the same optimal temperature and stability，however the optimal pH was slightly increased.The immobilized GS has the same conversion rate of 92.83%when 50 mmol/L glutamate was added in the bioconversion system.This work is useful for further large-scale bioproduction of glutamine.

glutamine synthetase，expression，immobilization，bioconversion

Q 78

A

1673—1689（2016）08—0883—07

2015-02-13

鄭璞（1966-），女，江蘇無錫人，工學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事發(fā)酵工程研究。E-mail：zhengpu@jiangnan.edu.cn