尹思淇， 李 聰， 吳 燕， 李 會(huì)， 史勁松， 許正宏

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

Colletotrichum lini ST-1靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化DHEA制備7α，15α-diOH-DHEA的工藝

尹思淇， 李 聰， 吳 燕， 李 會(huì)*， 史勁松， 許正宏

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

利用亞麻刺盤孢（Colletotrichum lini ST-1）靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化去氫表雄酮，制備三羥基雄甾烯酮，通過(guò)單因素優(yōu)化確定了最佳搖瓶轉(zhuǎn)化條件：細(xì)胞質(zhì)量濃度為12 g/L，pH值為6.5，裝液量為30 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速為220 r/min，溫度為30℃。在上述條件下，底物投料質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化48 h，產(chǎn)物摩爾得率為38.5%，較生長(zhǎng)細(xì)胞提高了21.0%。在上述工作基礎(chǔ)上，嘗試了靜息細(xì)胞連續(xù)批次轉(zhuǎn)化，最終通過(guò)兩批次的連續(xù)轉(zhuǎn)化，在底物累計(jì)投料質(zhì)量濃度為18 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化78 h，產(chǎn)物的累積質(zhì)量濃度高達(dá)12.1 g/L，產(chǎn)物摩爾得率可達(dá)60.5%。

亞麻刺盤孢；去氫表雄酮；三羥基雄甾烯酮；靜息細(xì)胞；批次轉(zhuǎn)化

靜息細(xì)胞是指一類可以進(jìn)行有氧非生長(zhǎng)代謝的細(xì)胞，通常將培養(yǎng)好的細(xì)胞懸浮于不含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或只含碳源（如葡萄糖）的轉(zhuǎn)化液中，然后添加底物進(jìn)行生物催化反應(yīng)。這種轉(zhuǎn)化方式彌補(bǔ)了傳統(tǒng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化的諸多不足［1-2］，便于對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行控制；減少了反應(yīng)過(guò)程干擾因子，保證了催化反應(yīng)的高效性和專一性；有利于產(chǎn)物的分離純化。目前，靜息細(xì)胞法已經(jīng)被應(yīng)用于天然化合物的特定位點(diǎn)催化、有機(jī)化合物的不對(duì)稱反應(yīng)、藥物前體化合物的生物合成及藥物活性成分的篩選及新藥研究等多個(gè)領(lǐng)域［3-4］。

去氫表雄酮（DHEA）可用于合成多種甾體激素類藥物的中間體，具有抗衰老及蛋白質(zhì)同化作用，其代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答［5］。DHEA通過(guò)生物轉(zhuǎn)化作用，在C7位和C15位分別加入一個(gè)氧原子，生成具有重要醫(yī)用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值的甾體激素藥物三羥基雄甾烯酮。三羥基雄甾烯酮（7α，15α-diOH-DHEA）是合成新型口服避孕藥“優(yōu)思明”主要成分屈螺酮的關(guān)鍵中間體［6］?！皟?yōu)思明”是全球銷量第一的女用口服避孕藥，具有高效、低毒、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，全球需求量大，市場(chǎng)前景廣闊。Colletotrichum lini是現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中可以催化底物DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)的菌株，目前主要采用生長(zhǎng)的全細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率低（僅 60%左右），底物投料質(zhì)量濃度低于8 g/L［7-8］。以實(shí)驗(yàn)室誘變得到的一株C.lini ST-1為研究對(duì)象［9］，研究以靜息細(xì)胞法制備7α，15α-diOHDHEA的工藝過(guò)程，從而進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)化效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

亞麻刺盤孢（C.linli ST-1），由作者所在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)復(fù)合誘變方法篩選得到。

1.2 培養(yǎng)基

1）斜面固體培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200，葡萄糖20，瓊脂20；自然pH，121℃滅菌20 min。

2）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米漿3，豆餅粉10；自然pH，121℃滅菌20 min。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15，酵母粉 15，玉米漿3；自然pH，121℃滅菌20 min。

4）轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 （g/L）：Na2HPO4·12H2O 22.56，NaH2PO4·2H2O 21.37。

1.3 菌體的培養(yǎng)

從斜面挑取適量菌絲接入含有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL的錐形瓶中，于220 r/min，30℃搖床條件下培養(yǎng)72 h。將培養(yǎng)好的一級(jí)種子以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接至新的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化，搖床條件220 r/min，30℃，培養(yǎng)24 h。

1.4 生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量將二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至30 mL/250 mL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，于220 r/min，30℃搖床培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)24 h后，準(zhǔn)確稱取10 g/L的DHEA于培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每隔6 h取樣檢測(cè)。

1.5 靜息細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量將二級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至30 mL/250 mL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h（搖床條件220 r/min，30℃）。離心收集菌絲體，用事先配制的磷酸鈉緩沖液洗滌菌體2遍，離心 （8 000 r/ min，10 min）收集菌體。準(zhǔn)確稱取3.5 g濕質(zhì)量的菌體，投入含有30 mL磷酸鈉緩沖液的250 mL的搖瓶中 （細(xì)胞干質(zhì)量12 g/L），同時(shí)添加10 g/L的DHEA和質(zhì)量濃度2 g/dL的吐溫80進(jìn)行轉(zhuǎn)化，搖床條件為220 r/min，30℃。轉(zhuǎn)化過(guò)程中每隔6 h取樣檢測(cè)。

1.6 靜息細(xì)胞批次轉(zhuǎn)化

準(zhǔn)確稱取3.5 g濕質(zhì)量的菌體投入含有30 mL磷酸鈉緩沖液（pH 6.5，0.2 mol/L）的250 mL的搖瓶中（細(xì)胞干質(zhì)量12 g/L），同時(shí)添加10 g/L的DHEA 和2 g/dL的吐溫80進(jìn)行轉(zhuǎn)化。搖床條件為220 r/ min，30℃，轉(zhuǎn)化過(guò)程中每隔6 h取樣檢測(cè)。當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)化率達(dá)到90%時(shí)，結(jié)束第一批次的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化液離心后倒出上清液，將菌體重新置于新的磷酸鈉緩沖液中，重新添加4～10 g/L的底物和1 g/dL的吐溫80進(jìn)行第二批次的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件相同。第三批次的轉(zhuǎn)化條件同第二批次。

1.7 薄層層析檢測(cè)產(chǎn)物

用移液器吸取500 μL的轉(zhuǎn)化液，用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，充分振蕩10 min，用移液器吸取2.5 μL上清液點(diǎn)樣，然后在展開(kāi)劑（氯仿-甲醇體積比=15∶1）中展開(kāi)10～15 min，用顯色劑（濃硫酸-乙醇體積比=1∶1）進(jìn)行顯色，105℃加熱2 min。

1.8 高效液相檢測(cè)產(chǎn)物

轉(zhuǎn)化結(jié)束后取800 μL轉(zhuǎn)化液，用800 μL乙酸乙酯反復(fù)萃取5～6遍。合并萃取過(guò)程的上清液，濃縮得到底物和產(chǎn)物的混合物，復(fù)溶于8倍體積的乙腈中，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾除雜，采用HPLC定量分析。分析條件：安捷倫C18反相柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相（乙腈-水體積比=7∶3），柱溫30℃，體積流量0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 206 nm。產(chǎn)物摩爾得率（7α，15α-diOH-DHEA）的計(jì)算公式如下：

式（1）中：X為液相測(cè)得的產(chǎn)物質(zhì)量濃度，g/L；c為投加的底物質(zhì)量濃度，g/L；M為底物與產(chǎn)物的摩爾質(zhì)量，g/moL。文中產(chǎn)物特指7α，15α-diOH-DHEA，不包含副產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌齡對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程主要依賴胞內(nèi)酶的活力，而菌體的不同生長(zhǎng)階段，其生理活性和酶表達(dá)水平有非常大的差異。因此，以不同生長(zhǎng)階段的菌體制備成靜息細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)化DHEA（10 g/L），菌體質(zhì)量濃度為10 g/L，在30℃，220 r/min搖床條件下轉(zhuǎn)化24 h，檢測(cè)其產(chǎn)物的摩爾得率，結(jié)果如表1所示。隨著菌體培養(yǎng)時(shí)間的增加，產(chǎn)物的摩爾得率增加明顯；在菌體培養(yǎng)到24 h時(shí)，產(chǎn)物摩爾得率最高為34.3%；當(dāng)菌體培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)24 h時(shí)，產(chǎn)物摩爾得率又出現(xiàn)了下降。因此選擇培養(yǎng)時(shí)間為24 h的菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

表1 菌齡對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響Table1 Effect of mycelia age on molar product yield

2.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的條件優(yōu)化

2.2.1 細(xì)胞質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 考察了不同的細(xì)胞質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響，底物投料質(zhì)量濃度為10 g/L，220 r/min，30℃搖床條件下轉(zhuǎn)化48 h（見(jiàn)圖1）。由圖1可以看出，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)，產(chǎn)物的摩爾得率最高，而當(dāng)細(xì)胞質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時(shí)，產(chǎn)物摩爾得率呈下降趨勢(shì)。因此，反應(yīng)過(guò)程細(xì)胞質(zhì)量濃度應(yīng)控制在12～14 g/L之間。

2.2.2 pH值對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 考察了不同pH值對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響，結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH值對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響較大，且酸性環(huán)境較堿性環(huán)境更有利于反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)pH值為6.5時(shí)，產(chǎn)物的摩爾得率最高。分析其原因，pH值對(duì)酶活性的影響較大，弱酸性的條件下，酶的活性較高。因此，選擇轉(zhuǎn)化的最適pH值為6.5。

圖1 細(xì)胞質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響Fig.1 Effect of cell concentration on molar product yield

圖2 pH值對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響Fig.2 Effect of pH on molar product yield

2.2.3 溶氧對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 DHEA羥基化過(guò)程需要氧的參與［10］，因此轉(zhuǎn)化過(guò)程的溶氧水平與7α，15αdiOH-DHEA的產(chǎn)量有著密切的聯(lián)系。在搖瓶轉(zhuǎn)化過(guò)程中裝液量和轉(zhuǎn)速是影響溶氧的兩個(gè)主要因素，考察了250 mL的搖瓶轉(zhuǎn)化過(guò)程中不同裝液量及轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響，如圖3和圖4所示。

圖3 裝液量對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響Fig.3 Effect of liquid volume on molar product yield

由圖3可知，在250 mL的錐形瓶中裝液量為30 mL時(shí)，產(chǎn)物的摩爾得率最高；當(dāng)裝液量過(guò)高或者過(guò)低時(shí)，產(chǎn)物摩爾得率出現(xiàn)了不同程度的降低。分析其原因，裝液量太大會(huì)影響氧分子傳遞，使反應(yīng)過(guò)程溶氧降低，限制轉(zhuǎn)化的進(jìn)行；而裝液量太小，相同的轉(zhuǎn)速下菌體振蕩幅度太大，剪切力過(guò)大容易造成菌絲體斷裂。因此，選擇最適轉(zhuǎn)化的裝液量為30 mL/250 mL。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響Fig.4 Effect of rotation speed on molar product yield

由圖4可知，轉(zhuǎn)速的變化對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響很明顯，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，產(chǎn)物摩爾得率最高；轉(zhuǎn)速在160～220 r/min，隨著轉(zhuǎn)速的增加，產(chǎn)物摩爾得率也逐漸增加；轉(zhuǎn)速超過(guò)220 r/min時(shí)，產(chǎn)物摩爾得率開(kāi)始下降。分析其原因，在一定范圍內(nèi)轉(zhuǎn)速的增加有利于溶氧的提高，也利于氧分子的傳遞，可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化的進(jìn)行；而轉(zhuǎn)速過(guò)大時(shí)，高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的強(qiáng)剪切力會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的菌體造成損傷，不利于轉(zhuǎn)化進(jìn)行。因此，選擇最適轉(zhuǎn)速為220 r/min。

2.2.4 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 由圖5可以看出，溫度變化對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響非常大，當(dāng)溫度超過(guò)35℃，轉(zhuǎn)化過(guò)程受到明顯抑制，而在30℃時(shí)可以得到最高的產(chǎn)物摩爾得率。分析其原因，酶對(duì)反應(yīng)溫度非常敏感，溫度過(guò)高，酶活受到抑制，而低溫亦不利于轉(zhuǎn)化進(jìn)行。因此，選擇最適反應(yīng)溫度為30℃。

圖5 溫度對(duì)產(chǎn)物摩爾得率的影響Fig.5 Effect of temperature on molar product yield

2.2.5 轉(zhuǎn)化過(guò)程分析 在上述轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)比了靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化和傳統(tǒng)生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的曲線。如圖6所示，利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化DHEA的產(chǎn)物摩爾得率較生長(zhǎng)細(xì)胞的產(chǎn)物摩爾得率要高，在轉(zhuǎn)化48 h后，產(chǎn)物摩爾得率提高了21.0%，表明靜息細(xì)胞可用于DHEA的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，且較生長(zhǎng)細(xì)胞存在一定的優(yōu)勢(shì)。

2.3 靜息細(xì)胞批次轉(zhuǎn)化

霉菌較長(zhǎng)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化周期是限制其工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)重要因素，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化較生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞的可重復(fù)利用。由于轉(zhuǎn)化過(guò)程底物的溶解度非常小，所以在底物投料的同時(shí)添加2 g/dL的吐溫80作為底物助溶劑。圖7是底物投料質(zhì)量濃度10 g/L時(shí)，添加2 g/dL的吐溫80助溶后的轉(zhuǎn)化曲線。由圖7可知，在轉(zhuǎn)化進(jìn)行到30 h時(shí)，底物的利用率已達(dá)到90%，且產(chǎn)物摩爾得率也趨于平穩(wěn)，此時(shí)可進(jìn)行第二批次轉(zhuǎn)化。

圖6 靜息細(xì)胞和生長(zhǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化曲線比較Fig.6 Conversion curves with resting cells and growing cells

圖7 優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化曲線Fig.7 Conversion curves after optimization

DHEA的水溶性較差，產(chǎn)物在增加了兩個(gè)羥基后親水性得到改善，因此轉(zhuǎn)化液離心后上清液中的主要成分為7α，15α-diOH-DHEA，若此時(shí)取出菌體重新置于新的轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，既可以提高菌體的利用率，同時(shí)也有利于解除產(chǎn)物的反饋抑制。考慮到底物對(duì)菌體的毒性，在批次轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)物得率會(huì)出現(xiàn)明顯的降低，因此需要逐批降低底物的投料質(zhì)量濃度并適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間。

如表2所示，在第二批次轉(zhuǎn)化過(guò)程中，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，產(chǎn)物摩爾得率出現(xiàn)了明顯的下降，底物投料質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化48 h，產(chǎn)物摩爾得率不足30%；投料質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化相同的時(shí)間，產(chǎn)物積累的質(zhì)量濃度最高為4.5 g/L，故將8 g/L作為第二批次的底物投料質(zhì)量濃度。

表2 第二批次投料質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Table2 Effect of substrate concentration on the second batch conversion

第三批次投料質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響如表3所示。

表3 第三批次投料質(zhì)量濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Table3 Effect of substrate concentration on the third batch conversion

菌絲體在進(jìn)行第三批次轉(zhuǎn)化時(shí)，投料質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，產(chǎn)物摩爾得率已低于50%；投料質(zhì)量濃度增加到8 g/L，產(chǎn)物積累質(zhì)量濃度不足1 g/L。綜合考慮生產(chǎn)效益，宜選用靜息細(xì)胞兩批次轉(zhuǎn)化，投料質(zhì)量濃度為第一批次10 g/L（30 h），第二批次8 g/L（48 h），最終產(chǎn)物累計(jì)質(zhì)量濃度可達(dá)12.1 g/L。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)對(duì)C.lini ST-1靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化DHEA的反應(yīng)條件（包括細(xì)胞濃度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速和溫度）進(jìn)行單因素優(yōu)化，產(chǎn)物摩爾得率較生長(zhǎng)細(xì)胞提高了21.0%，表明了C.lini ST-1靜息細(xì)胞可用于DHEA的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。在上述條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，考察了靜息細(xì)胞的批次轉(zhuǎn)化，得到了最佳的批次轉(zhuǎn)化條件，最終在總投料質(zhì)量濃度為18 g/L時(shí)，產(chǎn)物的累積質(zhì)量濃度達(dá)到了12.1 g/L，產(chǎn)物摩爾得率達(dá)到了60.5%，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平。綜上，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化不僅可以提高產(chǎn)物的摩爾得率，而且可以提高菌體的利用效率。

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Bioconversion of Dehydroepiandrosterone to 3β，7α，15α-Trihydroxy-5-Androsten-17-One by Colletotrichum lini ST-1 Resting Cells

YIN Siqi， LI Cong， WU Yan， LI Hui*， SHI Jingsong， XU Zhenghong
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The bioconversion of dehydroepiandrosterone （DHEA）to 3β，7α，15α-trihydroxy-5-androsten-17-one by Colletotrichum liniST-1 resting cells was investigated.The optimal transformation parameters in flasks were cell concentration 12 g/L，pH 6.5，liquid volume 30 mL/250 mL，rotational speed 220 r/min and temperature 30℃，which resulted in a molar product yield of 38.5%for 7α，15α-diOH-DHEA that was 20.1%higher than that from growing cells.Based on these conditions，two-batch bioconversion for 78 h with resting cells at a total substrate concentration of 18 g/L resulted in a concentration of 12.1 g/L and a molar product yield of 60.5%for 7α，15αdiOH-DHEA.

Colletotrichum lini ST-1；dehydroepiandrosterone；3β，7α，15α-trihydroxy-5-androsten-17-one；resting cells；batch conversion

Q 815

A

1673—1689（2016）08—0801—05

2015-03-11

國(guó)家863計(jì)劃重大項(xiàng)目（2011AA02A211）。

李 會(huì)（1983—），女，河北唐山人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生物制藥研究。E-mail：lihui@jiangnan.edu.cn