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        大豆7S球蛋白與葡聚糖共價鍵合納米凝膠的制備與表征

        2016-09-26 05:43:45馮紀璐齊軍茹翁靜宜劉倩茹曹靜程萌
        化工學報 2016年9期
        關鍵詞:共價葡聚糖水性

        馮紀璐,齊軍茹,翁靜宜,劉倩茹,曹靜,程萌

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        大豆7S球蛋白與葡聚糖共價鍵合納米凝膠的制備與表征

        馮紀璐,齊軍茹,翁靜宜,劉倩茹,曹靜,程萌

        (華南理工大學食品科學與工程學院,廣東 廣州 510640)

        基于蛋白質(zhì)與多糖的Maillard反應與自組裝制備一種新型的綠色的具備核殼結構的納米凝膠。利用干熱反應制備大豆7S球蛋白與葡聚糖的共價接枝物(soy β-conglycinin-dextran conjugates,SDC),通過對SDC熱處理使其自組裝成大豆7S球蛋白-葡聚糖納米凝膠(soy β-conglycinin-dextran nanogels,SDN),對其形貌、結構及性質(zhì)進行分析,并利用多糖的空間位阻效應抑制蛋白質(zhì)宏觀過度聚集的理論指導,探討尺寸均一SDN的形成機制。形貌學與zeta電位分析表明SDN為具備核殼結構的球狀粒子,其外殼由親水性的葡聚糖構成,內(nèi)核由凝膠化的蛋白構成;表面疏水性分析表明內(nèi)核蛋白的三級結構發(fā)生轉變,疏水基團暴露,從而形成多個疏水空腔;穩(wěn)定性分析表明SDN具有高度的pH穩(wěn)定性與儲存穩(wěn)定性,對疏水活性物質(zhì)的輸送載體構建具有重要的借鑒意義。

        大豆7S球蛋白;葡聚糖;Maillard反應;自組裝;核殼結構;納米凝膠

        引 言

        近年來,納米科技成為了最富活力及最具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d技術,納米材料由于其獨特的表面效應與小尺寸效應等得到了廣泛的關注。構建納米材料的方法分“從上至下”法(top down)和“從下至上”法(bottom up)[1]。自組裝作為一種“從下至上”法,是指基本單元自發(fā)地從無序狀態(tài)變成有序聚集體的方法[2-4]。2009年,Schmitt等[5]用1%(質(zhì)量)β-乳球蛋白在pH 3~7的范圍內(nèi)通過自組裝法制備β-乳球蛋白微膠。研究發(fā)現(xiàn),β-乳球蛋白在 pH<4.8或pH>5.6的條件下會形成線形可溶性聚集體,而在等電點范圍內(nèi)(pH 4.8~5.6)能形成具有膠體穩(wěn)定性的球形微膠。2014年,Chen等[6]用大豆蛋白在pH 5.9的條件下于95℃加熱制備具有一定穩(wěn)定性的大豆蛋白納米凝膠,但該納米凝膠具有pH敏感性。

        大量研究表明,兩親性嵌段共聚物可以自組裝形成穩(wěn)定的具有核殼結構的納米粒子[7-9]。蛋白與多糖是食品體系中兩大類天然大分子材料,通過自發(fā)的Maillard反應(糖基化反應)可以使蛋白的-或-氨基與還原糖的羰基發(fā)生共價結合,得到具有優(yōu)越功能特性的蛋白質(zhì)-多糖共價復合物(protein- polysaccharide conjugates,PPC)[10]。因此,通過Maillard反應制備出兩親性嵌段共聚物并進一步自組裝可以得到蛋白質(zhì)-多糖納米凝膠(protein-polysaccharide nanogels,PPN)。Wu等[11]利用Maillard反應的產(chǎn)物及其水解產(chǎn)物通過反溶劑法制備球形的納米粒子,但所用的戊二醛-乙醇交聯(lián)劑具有一定的毒性,不利于制備環(huán)境友好型納米材料。Li等[12]研究利用Maillard反應和加熱凝膠法制備水合直徑約為200 nm的溶菌酶-葡聚糖納米凝膠,并對布洛芬進行負載。研究表明,該納米凝膠具有較高的穩(wěn)定性,在一定pH范圍內(nèi)不發(fā)生聚集或解離。然而,研究表明,當顆粒的尺寸降至納米級(100 nm以下)時,有利于改善其在體內(nèi)的緩釋效果,增長其在體內(nèi)的循環(huán)時間[13-14]。

        大豆7S球蛋白是大豆中主要的蛋白,具有降低膽固醇、降血脂等改善脂肪代謝的功能[15]。國內(nèi)外關于大豆7S球蛋白與多糖的共價結合反應已經(jīng)有了相關的研究報道[15-17],在此研究基礎上進一步發(fā)現(xiàn)大豆7S球蛋白通過多糖共價結合后可以很好地進一步組裝形成納米凝膠,利用蛋白多糖復合物自組裝構建納米粒子,是一種安全無毒、綠色環(huán)保的加工方式。目前以Maillard 反應制備蛋白質(zhì)-多糖共價復合物納米凝膠的研究基本還未涉及。本文研究利用大豆7S球蛋白糖基化反應和加熱變性自組裝法制備納米凝膠,通過對納米凝膠的粒徑、形貌、結構等的研究,系統(tǒng)地分析和闡述其自組裝的機理,并探討了納米凝膠具有高度穩(wěn)定性的根本原因。

        1 實驗材料和方法

        1.1 材料

        低溫脫脂豆粕購自山東省高唐藍山集團總公司;葡聚糖(48×103~90×103)與8-苯胺基-1-萘磺酸 (ANS)購自美國Sigma公司;其他生化試劑均為分析純。實驗用水為去離子水,電阻為15 MΩ。

        1.2 實驗儀器

        高速冷凍離心機,Himac CR 22G型,日本Hitachi公司;冷凍干燥機,Alpha-4型,德國Christ公司;激光動態(tài)粒度掃描儀,Nano-ZS型,英國Malvern公司;熒光分光光度計,F(xiàn)-7000型,日本Hitachi公司;透射電鏡(TEM),JEOL-100CXⅡ型,日本電子株式會社。

        1.3 大豆7S球蛋白的制備

        大豆7S球蛋白根據(jù)Nagano法[15]從低溫脫脂豆粕中分離而得。大豆7S球蛋白的蛋白含量由凱氏定氮法(N5.71)測量,蛋白含量為84.03%±0.82%。

        1.4 大豆7S球蛋白-葡聚糖共價復合物(soy β- conglycinin-dextran conjugates,SDC)的制備

        依據(jù)相關文獻及課題組的經(jīng)驗[15,18],利用Maillard反應制備SDC,使大豆7S球蛋白的-或-氨基與葡聚糖末端的還原羥基發(fā)生共價結合,并使反應控制在Maillard反應起始階段,得Amadori重排產(chǎn)物。分別取質(zhì)量比為1:1的大豆7S球蛋白和葡聚糖混合,將混合物溶解于去離子水中使其濃度各達100 g·L-1,充分攪拌4 h,調(diào)pH至7.0,并進行冷凍干燥。干燥后的粉末過篩孔尺寸為0.125 mm的篩網(wǎng),然后放置在底部裝有飽和KBr溶液的干燥器中(保持其相對濕度為79%),于60℃中反應4 d。所得產(chǎn)物按質(zhì)量體積比1:10的比例加入去離子水,攪拌一定時間使其充分溶解。10000離心15 min后,上清液進行冷凍干燥,所得粉末即為SDC,置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 大豆7S球蛋白-葡聚糖納米凝膠(soy β- conglycinin-dextran nanogles,SDN)的制備

        取一定量的SDC粉末溶解于一定量的去離子水中配成濃度為1 mg·ml-1的均一溶液,用0.1 mol·L-1的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.8,然后放置在95℃的水浴中孵育50 min,冷卻后即為SDN。

        1.6 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

        SDS-PAGE根據(jù)Laemmli法[19]實施,對SDC的形成進行分析。分離膠與濃縮膠的濃度分別為12%與5%。稱取一定量的樣品加入樣品緩沖溶液[0.125 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液,其中十二烷基硫酸鈉(SDS)含量為10 g·L-1、2-巰基乙醇(2-ME)含量為20 ml·L-1、甘油含量為50 ml·L-1、溴酚藍含量為0.25 g·L-1],使樣品中蛋白質(zhì)的含量為5 mg·ml-1。電極緩沖液為pH約為8.3的含有SDS的Tris-甘氨酸緩沖液。上樣前將樣品在沸水里加熱5 min,電泳的上樣量為10 μl。凝膠電泳于恒定電流下進行,樣品于濃縮膠時電流為40 mA,進入分離膠后將電流調(diào)為80 mA,當染料前沿距橡膠框底邊1 cm時停止電泳。電泳完成后,一片凝膠采用考馬斯亮藍R250染色45 min,染色后于脫色液中脫色至無底色,完成后膠片拍照分析;另一片凝膠用Schiff試劑在暗處染色16 h,再用5%醋酸脫色至紅色條帶顯現(xiàn),拍照分析。

        1.7 動態(tài)光散射(DLS)

        樣品的表觀流體力學直徑(h)和多分散系數(shù)(PDI)采用Zetasizer Nano-ZS儀器進行測量。樣品測量前不經(jīng)過濾,在25℃下測量3次取平均值。

        樣品的zeta電位同樣采用Zetasizer Nano-ZS儀器測量,激光器為4 mV的He-Ne激光器,入射波長為633 nm,于25℃下測量3次取平均值。

        1.8 透射電子顯微鏡(TEM)

        SDN的透射電鏡測試是在加速電壓為80 kV的JEM-2100F透射電鏡上進行的。用過膜的雙蒸水稀釋樣液至3 μg·μl-1,取5 μl滴至碳支持膜上,多余的樣液用濾紙吸去,再滴加10 μl 10 g·L-1的磷鎢酸進行負染色5 min,用濾紙吸去多余液體,在室溫下干燥12 h。

        1.9 蛋白表面疏水性(0)的測定

        蛋白樣品的表面疏水性(0)測定是利用8-苯胺基-1-萘磺酸 (ANS)作為熒光探針根據(jù)Haskard等[20]的方法修改進行的。將一定量的樣品用0.01 mol·L-1pH 4.8~12的標準緩沖液稀釋至一定濃度梯度(0.02~0.2 mg·ml-1)。取4 ml樣液與20 μl ANS溶液(8×10-3mol·L-1)混合均勻,測試前在暗處靜置3 min。采用F7000熒光分光光度計測量樣液的熒光強度,激發(fā)波長為390 nm,發(fā)射波長為470 nm。各濃度下實際熒光強度為樣液熒光強度減去空白液(即不添加ANS溶液的樣品)熒光強度,以樣品濃度為橫坐標,實際熒光強度為縱坐標,用最小二乘法進行擬合,所得直線的斜率即為蛋白樣品的表面疏水性。

        2 實驗結果與討論

        2.1 SDC的形成與鑒定

        糖基化產(chǎn)物的形成常用SDS-PAGE圖譜進行鑒定,濃縮膠與分離膠交界處譜帶的出現(xiàn)表明了高分子量物質(zhì)的生成[21]。SDC的SDS-PAGE圖譜如圖1所示,圖1(a)為蛋白染色圖譜,圖1(b)為糖染色圖譜。圖1(a)條帶1可以清晰地觀察到大豆7S球蛋白的3條特征譜帶——?,和亞基譜帶,與張曦[15]的研究結果一致,表明所提取的大豆7S球蛋白純度較高;條帶2中大豆7S球蛋白的特征譜帶顏色變淺,且分離膠頂部出現(xiàn)顏色較深的譜帶,說明高分子量的物質(zhì)得以形成。圖1(b)條帶1有譜帶出現(xiàn),因為大豆7S球蛋白為糖蛋白;條帶2中高分子量譜帶有明顯的顯色。因為中性的葡聚糖不能在糖染色電泳中往下移動,且大部分非共價相互作用在凝膠電泳中遭到破壞,因此糖基化產(chǎn)物蛋白染色和糖染色圖譜中濃縮膠與分離膠分界處的多分散性高分子量譜帶的出現(xiàn)證明了大豆7S球蛋白與葡聚糖發(fā)生了共價接枝,形成了共價復合物。

        圖1 蛋白質(zhì)染色和糖染色的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

        2.2 SDN的制備

        大豆7S球蛋白的等電點為4.8[22],系統(tǒng)地研究了一定大豆7S球蛋白濃度(0.1~10 mg·ml-1)的SDC在pH 3.8~5.8范圍內(nèi)于一定溫度(75~95℃)的水浴中孵育5~60 min所制備的SDN的表觀流體力學直徑(h)及多分散性系數(shù)(PDI)。研究發(fā)現(xiàn)蛋白濃度為1 mg·ml-1、pH為4.8、加熱溫度為 95℃、加熱時間為15~60 min的條件下均可制備出粒徑分布較窄的h為88~103 nm的納米凝膠。后續(xù)研究中選用加熱時間為50 min作為自組裝條件,該條件下制備出納米凝膠的粒徑分布如圖2所示。

        圖2 大豆7S球蛋白-葡聚糖納米凝膠的粒徑分布

        2.3 SDN的形貌與結構

        2.3.1 SDN的形貌學分析

        TEM圖像(圖3)顯示納米凝膠為具有核殼結構的球形粒子,顯色較淺的為親水性葡聚糖外殼,顯色較深的為疏水性大豆7S球蛋白內(nèi)核。由于葡聚糖外殼的結構較為疏松而蛋白內(nèi)核的結構較為緊密,因此在TEM制樣過程中葡聚糖容易發(fā)生脫水聚集而使外殼相互交聯(lián)[11]。此外,從TEM觀察到SDN粒子的粒徑(約為45 nm)較DLS測量的粒徑(83.33 nm±0.03 nm)小,推測是由于所制備的納米凝膠具有一般凝膠的溶脹作用,DLS測試是在水溶液狀態(tài)下,而TEM測試時樣品處于干燥狀態(tài),納米凝膠在兩種狀態(tài)下分別溶脹和收縮,具有一定的溶脹比。

        圖3 大豆7S球蛋白-葡聚糖納米凝膠的透射電鏡圖

        2.3.2 SDN的表面疏水性(0)分析

        8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)可與蛋白質(zhì)表面的疏水基團相互作用產(chǎn)生熒光光譜,采用ANS熒光探針法測定蛋白樣品的表面疏水性(0)可以反映蛋白空間構象的轉變[20]。圖4(a)為不同物質(zhì)在pH 7.0條件下的表面疏水性,其中,“heated β-conglycinin”為大豆7S球蛋白于60℃的干熱條件下加熱4 d的樣品,“mixture”為大豆7S球蛋白與葡聚糖的混合物。可見,heated β-conglycinin的0與天然的大豆7S球蛋白沒有本質(zhì)差別,表明干熱條件下蛋白的自聚集對蛋白的表面疏水性沒有影響?;旌衔锏?與大豆7S球蛋白的0相比略有下降但無本質(zhì)區(qū)別,表明游離的葡聚糖對蛋白表面疏水性沒有影響。共價復合物中蛋白的表面疏水性與大豆7S球蛋白沒有本質(zhì)性差異,因為糖基化產(chǎn)物的表面疏水性取決于兩個方面:一方面,蛋白在干熱反應條件下發(fā)生部分變性,分子內(nèi)部的疏水基團部分暴露于蛋白表面,使蛋白的0增加;另一方面,親水性的葡聚糖共價結合于蛋白表面,使糖基化產(chǎn)物的0下降。而SDN的表面疏水性與大豆7S球蛋白和糖基化產(chǎn)物相比顯著增加,這是由于在自組裝過程中蛋白受熱變性,疏水基團進一步暴露,導致0顯著增加,即蛋白的空間結構發(fā)生轉變。

        圖4 不同樣品的表面疏水性指數(shù)[a~g表示顯著性差異(p<0.05)]

        SDC與SDN在不同pH條件下的的表面疏水性如圖4(b)所示。在所研究的pH范圍內(nèi),SDN的0與SDC相比都顯著增加,再次表明SDN中大豆7S球蛋白的疏水基團暴露,其三級結構發(fā)生轉變。此外,兩者的表面疏水性差異在酸性條件下特別是在蛋白等電點附近尤其明顯。這是由于蛋白的結構在是由兩種作用力所決定的:吸引作用(主要為疏水聚集作用)和排斥作用(主要為靜電排斥作用),兩者的自由能基本相同[10,23]。因此,當?shù)鞍姿幍沫h(huán)境發(fā)生微小的變化(如pH的改變)就會使蛋白的結構發(fā)生轉變,從而導致其表面疏水性發(fā)生顯著的改變。SDN在pH條件下0的變化情況有利于其對疏水性生物活性物質(zhì)的裝載與釋放。

        2.3.3 SDN的zeta電位分析

        圖5為天然的大豆7S球蛋白、大豆7S球蛋白/葡聚糖混合物及CDN在不同pH條件下的zeta電位。三者在pH低于蛋白等電點(pH 4.8)時均帶正電荷,在高于等電點時均帶負電荷,在等電點附近不帶電。但與其他二者相比,CDN在pH范圍內(nèi)zeta電位的絕對值均比較低。Zhou等[24]利用茶多酚與葡聚糖-明膠的共價復合物通過復合凝聚過程形成具有核殼結構的茶多酚-明膠-葡聚糖復合凝聚膠束(C3Ms),研究其zeta電位值發(fā)現(xiàn)C3Ms的電位絕對值較低,從而分析C3Ms是以葡聚糖為殼,明膠-茶多酚的復合凝聚為核。類似的,本研究中SDN同樣具備核殼結構,以不帶電的葡聚糖為殼,以大豆7S球蛋白為核,與上述TEM測試結果一致。

        圖5 不同樣品在pH 2~12范圍內(nèi)的zeta電位

        2.4 SDN的組裝機理

        綜合上述討論結果,推測具備核殼結構的SDN其組裝機理如下:親水性的葡聚糖通過Maillard干熱反應接枝到大豆7S球蛋白上,制得具有兩親性的大豆7S球蛋白-葡聚糖嵌段接枝物。經(jīng)過進一步的熱處理,大豆7S球蛋白發(fā)生變性并凝膠化,分子內(nèi)部的疏水基團暴露,在疏水聚集的作用下蛋白有聚集的趨勢,但共價接枝到蛋白上的葡聚糖發(fā)揮空間位阻效應阻止蛋白聚集并形成納米凝膠。親水性的葡聚糖在加熱條件下自組裝形成外殼,而部分凝膠化的具有一定空間網(wǎng)絡結構的大豆7S球蛋白自發(fā)形成內(nèi)核,從而使納米凝膠具備核殼結構。從表面疏水性分析討論可得,蛋白的疏水性鏈段在熱變性處理階段后暴露于分子表面,使納米凝膠內(nèi)核形成多個疏水空腔,此結構對于疏水分子具有較高的親和度,因此可以用于運載疏水性生物活性物質(zhì)。SDN的模型如圖6所示。

        圖6 大豆7S球蛋白-葡聚糖納米凝膠的模型

        2.5 SDN的穩(wěn)定性

        蛋白質(zhì)屬于聚兩性電解質(zhì),在等電點附近所帶的靜電荷為零,在疏水聚集作用的驅(qū)動下會產(chǎn)生聚集體。研究表明,未經(jīng)親水性修飾的聚兩性電解質(zhì)納米粒子通常具有pH敏感性[25-26]。通過DLS觀察納米凝膠在pH 2~12條件下的穩(wěn)定性。圖7(a)顯示在所研究的pH范圍內(nèi),納米凝膠的粒徑?jīng)]有顯著變化,PDI值均小于0.2,表明所制備的納米凝膠具有高度的pH穩(wěn)定性。推測此種pH穩(wěn)定性來源于大豆蛋白的凝膠網(wǎng)絡結構和葡聚糖的立體效應與親水性。一方面,當pH遠離大豆7S球蛋白的等電點時,內(nèi)核的蛋白由于靜電排斥作用趨于相互遠離,但在熱處理的過程中所形成的凝膠網(wǎng)絡結構使納米凝膠的粒徑保持穩(wěn)定;另一方面,當pH接近p時,處于不同內(nèi)核的蛋白在疏水聚集作用下趨向于彼此聚集,但通過Maillard反應共價接枝到蛋白上的葡聚糖由于空間位阻效應與親水性屏蔽了內(nèi)核的蛋白,使SDN保持穩(wěn)定。

        圖7 大豆7S球蛋白-葡聚糖納米凝膠的穩(wěn)定性

        圖7(b)為SDN在4℃下儲存13個月的粒徑分布。結果顯示,SDN沒有發(fā)生二次聚集且粒徑基本沒有改變,表明所制備的納米凝膠處于熱力學平衡狀態(tài)[27],在長期儲存中能維持穩(wěn)定。圖7(c)為新鮮制備的與凍干復溶的SDN的DLS測試結果。凍干后的SDN粉末無須借助超聲等手段便可立即復溶分散于蒸餾水中,具有較好的水合分散性,此外復溶后納米凝膠的粒徑和粒徑分布與新鮮制備的納米凝膠差異不大,表明納米凝膠溶液可以進行凍干并以粉末的形式進行保存。以上各種優(yōu)異的特性為納米凝膠在食品工業(yè)中的應用提供了可能性。

        3 結 論

        本研究通過糖基化反應和自組裝方法成功地制備了粒徑約90 nm的具備核殼結構的納米凝膠,并通過透射電鏡、激光動態(tài)粒度掃描儀和熒光分光光度計等分析手段得到以下結論。

        (1)形貌學觀察可得納米凝膠為具有核殼結構的球形粒子,zeta電位證實納米凝膠以葡聚糖為殼,大豆7S球蛋白為核。

        (2)表面疏水性結果表明納米凝膠內(nèi)大豆7S球蛋白的三級結構遭到破壞,疏水基團暴露而使納米凝膠內(nèi)核形成多個疏水空腔,有利于運載疏水性物質(zhì)。

        (3)所制備的納米凝膠具有高度穩(wěn)定性。在pH 2~12范圍內(nèi)沒有二次聚集,其粒徑基本不變;在4℃下存放13個月粒徑變化不大;凍干復溶對納米凝膠的粒徑基本沒有影響。具有良好的應用前景。

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        Preparation and characterization of soy β-conglycinin-dextran nanogels based on Maillard reaction

        FENG Jilu, QI Junru, WENG Jingyi, LIU Qianru, CAO Jing, CHENG Meng

        (School of Food Science and Technology, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong, China)

        The novel protein-polysaccharide nanogels were fabricated through a combination of Maillard reaction and self-assembly method, which is facile, safe and green. First, amphiphilic soy β-conglycinin-dextran conjugates (SDC) were prepared by grafting dextran onto soy β-conglycininMaillard dry-heating reaction. Then, a heat treatment above the denaturation temperature of protein was used to form soy β-conglycinin-dextran nanogels (SDN). The morphology observation indicated that SDN were of spherical shape with core-shell structures, and the zeta-potential study further verified that soy β-conglycinin was covered with nonionic dextran. The surface hydrophobicity investigation displayed that the conformation of protein was changed and the hydrophobic groups of soy β-conglycinin were exposed to the surface of protein. Therefore, several hydrophobic compartments were formed in the core. The nanogels were pretty stable against long-term storage and pH change. These valuable properties and the low toxicity of nanogels may provide a promising way to deliver hydrophobic compounds.

        soy β-conglycinin; dextran; Maillard reaction; self-assembly; core-shell structure; nanogels

        supported by the National Natural Science Foundation of China (31370036) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2015Z2119).

        date: 2016-01-11.

        Prof. QI Junru, jrqi@scut.edu.cn

        TS 201.7

        A

        0438—1157(2016)09—4020—07

        10.11949/j.issn.0438-1157.20160046

        國家自然科學基金項目(31370036);中央高?;究蒲袠I(yè)務費專項資金(2015Z2119)。

        2016-01-11收到初稿,2016-05-06收到修改稿。

        聯(lián)系人:齊軍茹。第一作者:馮紀璐(1992—),女,碩士研究生。

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