黃愛妮，汪海波，李麗，胡小泓，周勝男（.武昌工學(xué)院食品工程學(xué)院，湖北武漢 430065；.武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢43003）

鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白提取工藝研究

黃愛妮1，汪海波2，李麗1，胡小泓1，周勝男1
（1.武昌工學(xué)院食品工程學(xué)院，湖北武漢 430065；2.武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023）

以鰱魚魚皮為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取工藝參數(shù)進(jìn)行分析，并用AR-500動(dòng)態(tài)流變儀對(duì)鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度進(jìn)行分析。結(jié)果表明：鰱魚魚皮原料中酸溶性膠原蛋白提取的最佳工藝條件為：以乙酸作為提取劑，乙酸濃度0.3 mol/L，料液比1∶60（g/mL），提取時(shí)間96 h；此膠原蛋白的熱變性起始溫度為32.31℃，峰值溫度為34.82℃。

鰱魚皮；酸溶性膠原蛋白；提取

膠原又稱膠原蛋白，是動(dòng)物體內(nèi)含量多、分布廣的蛋白質(zhì)，約占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%。膠原蛋白在傳統(tǒng)上主要是從陸生動(dòng)物如豬、牛等的皮、骨中提取，但由于牲畜疾病的爆發(fā)，以及宗教信仰等原因，豬、牛等來源的膠原蛋白制品的提取和使用受到了限制［1-2］。哺乳動(dòng)物皮膚膠原的酸溶解性較低，而魚皮中膠原蛋白的酸溶解性相對(duì)較高，因此，作為豬、牛等的替代原料，從魚類加工廢棄物魚皮、魚鱗和魚骨等中提取酸溶性膠原蛋白，越來越受到人們的重視［3-5］。

我國是世界上最大的淡水魚養(yǎng)殖國，而湖北作為全國淡水魚生產(chǎn)第一大省，2014年湖北省全年水產(chǎn)品總量433.3萬t，連續(xù)19年居全國第一，水產(chǎn)業(yè)已成為湖北省農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要支柱。湖北主要養(yǎng)殖淡水魚品種包括青魚、草魚、鰱魚和鳙魚等。隨著魚類加工業(yè)的快速發(fā)展，加工過程中產(chǎn)生大量的廢棄物，包括魚皮、魚鱗和魚骨等，約占魚體總重的40%～55%［6］。據(jù)報(bào)道，魚皮中膠原蛋白含量最高可達(dá)80%以上［7-9］，因此從魚皮中提取膠原蛋白不僅能夠充分利用資源，提高魚類加工的附加值，而且可以減少環(huán)境污染，對(duì)促進(jìn)魚類加工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

目前，國內(nèi)外對(duì)鰱魚加工下腳料的研究主要集中在魚鱗的深加工，對(duì)魚皮的研究較少［10-12］。因此，本研究以鰱魚魚皮為原料，在低于膠原蛋白變性溫度的條件下進(jìn)行酸溶性膠原蛋白的提取，研究原料魚皮中酸溶性膠原蛋白提取的最佳工藝條件，并對(duì)其熱變性溫度進(jìn)行測定，以期為鰱魚魚皮的加工利用提供一些理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鰱魚皮：武漢市白沙洲菜場提供；L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；無水Na2CO3、氯胺T、對(duì)二甲氨基苯甲醛、NaOH、無水乙醚、乙酸、正丁醇、氯化鈉、鹽酸、檸檬酸等：均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SE602F型電子分析天平：奧豪斯儀器有限公司；T6型紫外分光光度計(jì)：北京普析儀器有限公司；HHS22型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LD5-2B型臺(tái)式低速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；FE20型酸度計(jì)：梅特普-托利多儀器有限公司；AR-500動(dòng)態(tài)流變儀：美國TA公司。

1.3方法

1.3.1鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的制備工藝路線

1.3.1.1工藝流程

魚皮→脫雜蛋白→瀝干后用水充分洗滌瀝干→脫脂→瀝干后用水充分洗滌瀝干→加酸溶解→過濾分離濾液和殘?jiān)鸀V液鹽析→離心分離→乙酸復(fù)溶→透析→凍干→酸溶性膠原蛋白

1.3.1.2操作要點(diǎn)

魚皮洗凈表面雜質(zhì)和黑色素，瀝干后剪碎，以0.6 mol/L的Na2CO3溶液為雜蛋白脫除試劑，在25℃下處理2次，每次6 h進(jìn)行脫雜蛋白處理；采用無水乙醚作為脫脂試劑，在料液比為1∶80（g/mL）下處理16 h進(jìn)行脫脂處理。脫雜后的魚皮用酸溶液溶解，在一定的溫度下浸提，浸提結(jié)束后過濾，棄去濾渣，將收集起來的濾液加入氯化鈉鹽析，使氯化鈉終濃度達(dá)2.6 mol/L，鹽析時(shí)間為14 h。鹽析后的溶液以5 000 r/min的速度離心20 min，棄去上清液，沉淀以0.5 mol/L醋酸溶解后，轉(zhuǎn)入透析袋以高純水透析，至無氯離子檢出。倒出透析袋中的膠原蛋白溶液，冷凍干燥后，得到酸溶性膠原蛋白產(chǎn)品。

1.3.2魚皮原料及提取液中羥脯氨酸含量的測定方法

膠原蛋白中的羥脯氨酸在其他蛋白中很少見，可視為膠原蛋白所特有的，因此，通過測定膠原蛋白中羥脯氨酸的含量，可以間接評(píng)價(jià)膠原蛋白的提取效果。

1.3.2.1羥脯氨酸的測定方法

L-羥脯氨酸經(jīng)氯胺T氧化后，與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色化合物，在波長558 nm處測定吸光度并與標(biāo)準(zhǔn)比較，可定量羥脯氨酸的含量。

取4.0 mL L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL比色管中，加入2.0 mL氯胺T溶液，混勻后于室溫下放置20 min。取4.0 mL水于25 mL比色管中，與標(biāo)準(zhǔn)液同步試驗(yàn)，可得空白。加入2.0 mL對(duì)二甲氨基苯甲醛與高氯酸按比例配制而成的顯色劑，充分混勻后，迅速將比色管放入60℃水浴中加熱20 min后取出比色管，用冰水冷卻比色管3 min，然后在室溫下放置30 min。用空白管作參比，在波長558 nm處以紫外分光光度計(jì)測定其吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值為縱坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2魚皮中羥脯氨酸提取率的計(jì)算

取1 g魚皮剪碎，放入100 mL具塞比色管中，加入30 mL 3 mol/L的硫酸溶液，并蓋上塞子，置于恒溫干燥箱中，105℃水解6 h。趁熱將水解產(chǎn)物用濾紙過濾至250 mL容量瓶中，用10 mL硫酸溶液分3次洗滌比色管或三角燒瓶和濾紙，濾干后，用10 mL水洗滌濾紙，合并上述溶液。用移液管移取10 mL該水解液至100 mL容量瓶中，加水50 mL，用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至中性再用水定容至刻度，所得溶液為待測液。取4.0 mL處理好的待測液于25 mL比色管中，按照1.3.2.1的方法測定魚皮原料中的羥脯氨酸含量。

魚皮原料進(jìn)行膠原蛋白提取后，按照上述方法測定提取液中的羥脯氨酸含量，按照式1計(jì)算羥脯氨酸提取率。

羥脯氨酸提取率/%=

1.3.3鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取工藝研究的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1提取劑種類對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預(yù)處理后的鰱魚皮3份，經(jīng)脫雜蛋白處理和脫脂處理后，分別加入0.5 mol/L的鹽酸、乙酸、檸檬酸80 mL，在一定的溫度下浸提72 h。浸提結(jié)束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計(jì)算膠原蛋白的提取率。

1.3.3.2提取劑濃度對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預(yù)處理后的鰱魚皮4份，經(jīng)脫雜蛋白處理和脫脂處理后，以乙酸為提取劑，分別調(diào)節(jié)乙酸濃度為0.3、0.5、0.7、0.9mol/L，料液比1∶80（g/mL），在4℃下浸提24h。浸提結(jié)束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計(jì)算膠原蛋白的提取率。

1.3.3.3提取時(shí)間對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預(yù)處理后的鰱魚皮4份，經(jīng)脫雜蛋白處理和脫脂處理后，以0.5 mol/L乙酸為提取劑，料液比為1∶80 （g/mL），在4℃下分別浸提24、48、72、96 h。浸提結(jié)束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計(jì)算膠原蛋白的提取率。

1.3.3.4料液比對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

取預(yù)處理后的鰱魚皮4份，經(jīng)脫雜蛋白處理和脫脂處理后，以0.5 mol/L乙酸為提取劑，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL），在4℃下浸提72 h。浸提結(jié)束后過濾，測定濾液中羥脯氨酸的含量，計(jì)算膠原蛋白的提取率。

1.3.4鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取工藝研究的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取劑濃度、提取時(shí)間、料液比為考察因素，以魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率為指標(biāo)，選擇L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表Table 1　Orthogonal factor level table

1.3.5鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度測定

用去離子水配制0.6%濃度的酸溶性膠原蛋白水溶液，用AR-500動(dòng)態(tài)流變儀分析溫度對(duì)膠原蛋白影響的趨勢，測定膠原蛋白的熱變性溫度。

2　結(jié)果與分析

2.1魚皮原料及提取液中羥脯氨酸含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過比色法，用空白作參照，在波長為558 nm處以紫外分光光度計(jì)測定出膠原蛋白中特有的羥脯氨酸含量的方法，來間接評(píng)價(jià)膠原蛋白的提取效果。用1.3.2的方法，繪制出羥脯氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1　羥脯氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of hydroxyproline content

測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.146x+0.013，式中：x為羥脯氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL）；y為558 nm處吸光度。R2= 0.987。

2.2鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1提取劑種類對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

提取劑種類對(duì)膠原蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　提取劑種類對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2　Effect of extracting agent types on collagen extraction rate

從圖2可以看出，在其他條件相同的情況下，乙酸對(duì)魚皮膠原蛋白的提取最高，提取率可達(dá)61.65%；鹽酸次之，提取率為44.06%；檸檬酸的提取率最低，為19.45%。因此，選擇乙酸作為鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白提取的最佳提取劑。

2.2.2提取劑濃度對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

提取劑濃度對(duì)膠原蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　提取劑濃度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3　Effect of extracting agent concentration on collagen extraction rate

從圖3中可看出，當(dāng)乙酸濃度在0.5 mol/L以下時(shí)，魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率隨著乙酸濃度的增大而增大，當(dāng)乙酸濃度為0.5 mol/L時(shí)，魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率最高。當(dāng)乙酸濃度繼續(xù)增大時(shí)，膠原蛋白的提取率反而下降，因此，選擇乙酸濃度為0.5 mol/L。

2.2.3提取時(shí)間對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4　提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.4　Effect of extracting time on collagen extraction rate

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，魚皮中膠原蛋白的提取率逐漸增大，說明魚皮中的膠原蛋白需要一定的時(shí)間才能被提取劑浸提出來。但當(dāng)浸提時(shí)間超過72 h后，膠原蛋白提取率的增加變緩，可能是由于提取劑的提取能力已經(jīng)達(dá)到飽和，考慮到節(jié)約提取成本，因此，選擇最佳提取時(shí)間為72 h。

2.2.4料液比對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響

料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5　料液比對(duì)魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on collagen extraction rate

從圖5可知，料液比分別為1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL）時(shí)，魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率分別為58.07%、61.65%、62.05%、62.68%，即料液比為1∶60（g/mL）時(shí)魚皮膠原蛋白的提取率最高。可能是由于提取劑用量較少時(shí)，魚皮原料與提取劑未能充分接觸，影響了提取效果，當(dāng)料液比逐漸降低，即提取劑用量逐漸增大時(shí)，膠原蛋白的提取率也隨之增大，但當(dāng)料液比從1∶60（g/mL）降低到1∶70（g/mL）后，提取率的增加變緩，考慮到節(jié)約試劑，因此，選擇最佳料液比為1∶60（g/mL）。

2.3酸溶性魚皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙酸濃度、提取時(shí)間、料液比為考察因素，以魚皮中酸溶性膠原蛋白的提取率為指標(biāo)，選擇L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果表見表2，方差分析表見表3。

由表2和表3可知，各因素對(duì)鰱魚皮中酸溶性膠原蛋白提取率的影響重要程度依次是乙酸濃度＞提取時(shí)間＞料液比，其中乙酸濃度、提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白的提取率都有非常顯著的影響，料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響很小。最優(yōu)方案為A2B3C1，即料液比1∶60 （g/mL），提取時(shí)間96 h，乙酸濃度0.3 mol/L。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2　Results of orthogonal experiment

表3方差分析表Table 3　Analysis on variance about orthogonal experiment

取預(yù)處理后的鰱魚皮，加入0.3 mol/L乙酸溶液進(jìn)行提取，調(diào)節(jié)料液比為1∶60（g/mL），浸提96 h，在此條件下對(duì)鰱魚皮中的酸溶性膠原蛋白進(jìn)行提取，提取率為76.23%，高于正交試驗(yàn)中所有工藝參數(shù)組合下的提取率，證明了正交試驗(yàn)的正確性。

2.4鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度

用去離子水配制0.6%濃度的酸溶性膠原蛋白水溶液，用AR-500動(dòng)態(tài)流變儀分析溫度對(duì)膠原蛋白影響的趨勢，測定得到鰱魚魚皮中酸溶性膠原蛋白的熱變性起始溫度為32.31℃，峰值溫度為34.82℃，因此，在提取過程中應(yīng)該將溫度控制在32.31℃以下。

3　結(jié)論

鰱魚魚皮原料中酸溶性膠原蛋白提取的最佳工藝條件為：以乙酸作為提取劑，乙酸濃度0.3 mol/L，料液比1∶60（g/mL），提取時(shí)間96 h；此膠原蛋白的熱變性起始溫度為32.31℃，峰值溫度為34.82℃。

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Study on Extraction of Acid-Soluble Collagens from Silver Carp Skin

HUANG Ai-ni1，WANG Hai-bo2，LI Li1，HU Xiao-hong1，ZHOU Sheng-nan1
（1.College of Food Engineering，Wuchang Institute of Technology，Wuhan 430065，Hubei，China；2.College of Chemical and Environmental Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

With silver carp fish skin as raw material，the optimal extraction parameters of acid-soluble collagens were explored by single factor test and orthogonal test.The denaturation temperatures of acid-soluble collagens were analyzed by AR-500 dynamic rheometer.The results showed that the optimal parameters for the extraction of acid-soluble collagens from silver carp skin were with acetate as the extraction agent，the concentration of acetic acid 0.3 mol/L，material/liquid ratio of 1∶60（g/mL）for 96 h.The starting denaturation temperature of acid-soluble collagens from silver carp skin was 32.31℃，and the peak temperature was 34.82℃.

silver carp skin；acid-soluble collagens；extraction

2015-10-13

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（B2014127）

黃愛妮（1985—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品新資源開發(fā)與利用。