武林賀，白新鵬，吳謙，徐小夢(mèng)，馬若影，李雪（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

脂肪酶水解椰子油動(dòng)力學(xué)研究

武林賀，白新鵬*，吳謙，徐小夢(mèng)，馬若影，李雪
（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

椰子油；脂肪酶；水解；動(dòng)力學(xué)

脂肪酶催化油脂水解生成油脂衍生物是一種高效、環(huán)保、低能耗的方法［1-2］，它是以酶作催化劑的酶解反應(yīng)，這種反應(yīng)是在溫和的條件下進(jìn)行的，不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)的油脂水解產(chǎn)物顏色深、發(fā)生熱聚合等現(xiàn)象，而且具有選擇性，反應(yīng)過(guò)程中不會(huì)發(fā)生腐敗變質(zhì)等現(xiàn)象，獲得的產(chǎn)物質(zhì)量較好，因此脂肪酶水解油脂的技術(shù)應(yīng)用逐漸廣泛［3-4］。椰子油［5-7］富含多種飽和脂肪酸甘油酯，椰子油衍生物是由椰子油水解產(chǎn)生的［8-9］，其中月桂酸等飽和脂肪酸多用于食品和日用品領(lǐng)域，而且需求量日漸增大［10-11］。目前主要是用天然植物油脂皂化分離、高溫高壓分解和合成脂肪酸等方法生產(chǎn)月桂酸等飽和脂肪酸。這些方法不但成本較高，而且在生產(chǎn)中會(huì)出現(xiàn)脂肪酸的氧化分解、產(chǎn)品顏色較深等現(xiàn)象［12-13］。在國(guó)外利用脂肪酶水解油脂生產(chǎn)油脂衍生物的方法已經(jīng)應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐當(dāng)中，美國(guó)和意大利已經(jīng)利用脂肪酶水解牛油和亞麻油來(lái)生產(chǎn)脂肪酸，其生產(chǎn)成本低，得到的脂肪酸的質(zhì)量較好［14］。而我國(guó)使用脂肪酶水解油脂的技術(shù)起步較晚，尤其是脂肪酶水解椰子油

1　材料與方法

1.1材料

海南本地高種椰子；脂肪酶（20萬(wàn)U/g）、纖維素酶（20萬(wàn)U/g）、木瓜蛋白酶（20萬(wàn)U/g）、β-葡聚糖酶（36萬(wàn)U/g）：購(gòu)自北京夢(mèng)怡生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Anke（GL21GII）高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；Re（52）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZD（III）真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HR（1724）型打漿機(jī)：珠海飛利浦家電公司；SHZ（B）恒溫水浴振蕩器：上海龍躍儀器有限公司；SHA（2）恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1椰子油的制備

采用水酶法制備椰子油，其工藝為采果、去椰衣、去種皮、打漿、酶解、滅酶、離心及干燥。將新鮮的椰子去椰衣和種皮后的椰肉破碎打漿，加入適量的水調(diào)節(jié)料液比，加入一定量的水解酶在一定的溫度下酶解一定的時(shí)間后進(jìn)行離心分離，將分離出的油脂部分進(jìn)行精煉處理得到椰子油。

1.3.2椰子油酸值的測(cè)定

將椰子油與水按一定比例混合，水浴加熱到反應(yīng)所需溫度，快速加入一定量脂肪酶，用玻璃棒攪拌均勻后放入恒溫水浴振蕩器開(kāi)始反應(yīng)。為保證反應(yīng)溫度恒定，每次取樣要少量快速。反應(yīng)后的樣品經(jīng)離心分離、干燥后，測(cè)定其酸值的變化。

1.3.3酶解動(dòng)力學(xué)的研究

1.3.3.1不同單因素條件對(duì)酶解速率的影響

研究底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)脂肪酶水解椰子油的影響。試驗(yàn)條件為底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間，在其它條件不變的情況下，分別改變酶解時(shí)間（20、40、60、80、100、120 min）、酶解溫度（45、50、55、60、65℃）、酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）和底物質(zhì)量濃度［0.2、0.4、0.6、0.8、1.0（g/mL）］，按1.3.2的方法進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測(cè)定酶解后的原生態(tài)椰子油的水解率，按照式（1）計(jì)算酸值變化速率，即反應(yīng)速率v［mg/（g·mL·min）］：

式中：A為酸值，mg/g；V為反應(yīng)體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.3.2酶解動(dòng)力學(xué)模型的建立

Michaelis-Menten對(duì)酶解反應(yīng)做了兩步假設(shè)，即酶與底物的酶促反應(yīng)按下面反應(yīng)步驟進(jìn)行：

式中：k1為ES生成的反應(yīng)速率常數(shù)；k2和k3分別代表ES分解為E+P和E+S的反應(yīng)速率常數(shù)；k4為E+ P生成ES的反應(yīng)速率常數(shù)。

首先，脂肪酶（E）與反應(yīng)底物（S）結(jié)合成反應(yīng)中間產(chǎn)物（ES），然后反應(yīng)中間產(chǎn)物分解成產(chǎn)物（P）后，脂肪酶被釋放出來(lái)。在反應(yīng)開(kāi)始階段，如果產(chǎn)物（P）的濃度較低或沒(méi)有產(chǎn)物（P）的反應(yīng)體系中，可逆反應(yīng)是不能發(fā)生的，因此k4過(guò)程可以忽略，第二步的反應(yīng)就可以看作是單向反應(yīng)，即可得出酶解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程：

式中：［S］為底物質(zhì)量濃度，g/mL；［E］total/（g/mL）＝［E］＋［ES］；［ES］為中間產(chǎn)物，g/mL。令km=（k2+k3）/k1，vm=k2［E］total，則方程（3）可簡(jiǎn)化為：

方程（4）即為米氏方程，其中km［mg/（g·mL）］為米氏常數(shù)；Vm［mg/（g·mL·min）］為最大反應(yīng)速率。將米氏方程進(jìn)行變形，即可得到方程（5）：

1.3.4分析方法

酸值按GB/T 5009.37-2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》測(cè)定。

1.3.5數(shù)據(jù)處理方法

每組試驗(yàn)分別進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)，用spss19.0 for Windows軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1酶解時(shí)間對(duì)椰子油酸值的影響

酶解時(shí)間是脂肪酶酶解油脂的主要影響因素。圖1顯示了酶解時(shí)間對(duì)椰子油酸值影響。

圖1　酶解時(shí)間對(duì)椰子油酸值的影響Fig.1　Effects of enzymolysis time on acid value

在一定的條件下，脂肪酶能夠結(jié)合在油脂的特定部位水解油脂，隨著酶解時(shí)間的增加椰子油不斷被脂肪酶水解，油脂中甘油一酯、甘油二酯和脂肪酸的含量逐漸增加，從而使脂肪酶可利用的底物濃度降低，導(dǎo)致反應(yīng)速率不斷下降，最終使得反應(yīng)速率基本保持恒定。從圖1可知，酶解反應(yīng)60 min最為適宜。

2.2溫度對(duì)椰子油水解速率的影響

圖2為溫度對(duì)椰子油酶解速率的影響。

圖2　溫度對(duì)椰子油水解速率的影響Fig.2　Effect of temperature on hydrolysis rate of coconut oil

由圖2可知，隨溫度不斷升高，椰子油的酸值變化速率逐漸增大，50℃時(shí)酸值變化速率最大，50℃以后，反應(yīng)速率迅速下降。隨著溫度的升高，首先達(dá)到酶反應(yīng)的最適溫度，使得反應(yīng)速率達(dá)到最大；但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，脂肪酶會(huì)因溫度的升高逐漸失活，從而導(dǎo)致酶促反應(yīng)速度迅速下降。

2.3酶添加量對(duì)椰子油水解速率的影響

圖3為酶添加量對(duì)椰子油酶解速率的影響。

由圖3可知，在反應(yīng)的起始階段，當(dāng)脂肪酶添加量逐漸增加時(shí)，反應(yīng)速率也隨之增大，反應(yīng)速率和酶添加量幾乎呈線性關(guān)系變化。在反應(yīng)體系中如果底物比較充足，隨著酶添加量的增加，反應(yīng)速率也隨之增大；當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，此時(shí)反應(yīng)底物不能滿足酶的需求，反應(yīng)速率開(kāi)始減小，并逐漸變慢。本試驗(yàn)是在底物充足的條件下進(jìn)行的，因此，酶添加量與酸值的變化速率幾乎呈現(xiàn)線型的規(guī)律變化。

圖3　酶添加量對(duì)椰子油水解速率的影響Fig.3　Effect of enzyme concentration on hydrolysis rate of coconut oil

2.4底物質(zhì)量濃度對(duì)椰子油酶解速率的影響

圖4為底物質(zhì)量濃度對(duì)椰子油酶解速率的影響。

圖4　底物質(zhì)量濃度對(duì)椰子油水解速率的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis rate of coconut oil

由圖4可知，當(dāng)酶添加量一定時(shí)，酶解反應(yīng)速率隨著底物質(zhì)量濃度的增加，酶解速率先增大然后趨于平緩。反應(yīng)剛開(kāi)始，反應(yīng)體系中底物質(zhì)量的濃度較低，水解速率較快，反應(yīng)速率基本成線性增加；當(dāng)繼續(xù)增加底物質(zhì)量濃度時(shí)，水解速率逐漸變得平緩，這可能是由于酶幾乎全部與底物結(jié)合，此時(shí)反應(yīng)的速率和底物的濃度基本無(wú)關(guān)。圖4顯示了［S］與v的關(guān)系，兩者符合典型的雙曲線關(guān)系，符合米氏方程酶促反應(yīng)特征的，因此可以采用米氏方程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，求得動(dòng)力學(xué)模型。

2.5動(dòng)力學(xué)研究

2.5.1Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法求解方程參數(shù)

圖5Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖Fig.5　Lineweaver-Burk plot

方程的相關(guān)系數(shù)R2＝0.991 2，方程極顯著。

2.5.2Wilkinson法求解酶解方程參數(shù)

Wilkinson統(tǒng)計(jì)法是研究動(dòng)力學(xué)的一種方法，一般應(yīng)用于酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究中，研究方法可靠，但是計(jì)算過(guò)程復(fù)雜。它有兩步計(jì)算，第一步是最小二乘法求估算解，求得估算值，在估算值的基礎(chǔ)上再利用泰勒展開(kāi)式求精校解，得出動(dòng)力學(xué)的模型。Wilkinson統(tǒng)計(jì)法求估算解見(jiàn)表1，Wilkinson統(tǒng)計(jì)法求精校解見(jiàn)表2。

表1為最小二乘法求估算解。由表1可知，△= αε-γδ=0.000 84

式中：Vm0、km0分別為最大反應(yīng)速率和米氏常數(shù)的估算解。

表2泰勒展開(kāi)式求精校解。由表2可得到，

式中：a1、a2分別為Vm、km計(jì)算修正系數(shù)。

最后可得到精校解為：Vm=Vm0a1=0.969 6［mg/（g· mL·min）］；km=km0+a2/a1=1.273 9［mg/（g·mL）］。

2.5.3Lineweaver-Buck和Wilkinson的比較

對(duì)于Lineweaver-Buck法而言，計(jì)算過(guò)程簡(jiǎn)單，用于質(zhì)量濃度在0.33 km～2.0 km反應(yīng)體系統(tǒng)較為精確；而Wilkinson統(tǒng)計(jì)法可用于動(dòng)力學(xué)的分析計(jì)算研究中，計(jì)算結(jié)果比較精確，但是其分析計(jì)算過(guò)程比較復(fù)雜。因此本試驗(yàn)又做了Wilkinson統(tǒng)計(jì)法校正，求出經(jīng)過(guò)精確校正后的Vm=0.969 6［mg/（g·mL·min）］，km= 1.273 9［mg/（g·mL）］。即得脂肪酶水解椰子油的米氏方程：

表1　Wilkinson統(tǒng)計(jì)法求估算解Table 1　Calculation of provisional values by Wilkinson method

表2　Wilkinson統(tǒng)計(jì)法求精校解Table 2　Fine adjustment of values by Wilkinson method

2.5.4椰子油酶解動(dòng)力學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

取不同質(zhì)量濃度的椰子油反應(yīng)體系，在酶添加量為1%、酶解溫度50℃條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)比兩種計(jì)算方法可以得到的脂肪酶酶解椰子油的動(dòng)力學(xué)方程的理論值和實(shí)測(cè)值，然后對(duì)方程進(jìn)行驗(yàn)證，以確定方程的準(zhǔn)確性和可靠性，見(jiàn)圖6。

圖6 酶解動(dòng)力學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)Fig.6　Validation of the developed hydrolysis kinetic model

由圖6可知，底物質(zhì)量濃度在0～0.6 g/mL范圍內(nèi)，可采用Lineweaver-Buck法計(jì)算反應(yīng)速率，計(jì)算得到的值與實(shí)際值比較接近；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度大于0.6 g/mL，使用Wilkinson統(tǒng)計(jì)法計(jì)算得到的計(jì)算值與真實(shí)值比較接近。而本試驗(yàn)中的底物質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，Wilkinson統(tǒng)計(jì)法可進(jìn)行方程的求解。而本試驗(yàn)米氏方程的擬合度較高，因此米氏方程也適合脂肪酶水解椰子油的動(dòng)力學(xué)研究。

3　結(jié)論

［1］Sharma A，Chaurasia S P，Dalai A K.Enzymatic hydrolysis of cod liver oil for the fatty acids production［J］.Catalysis Today，2013，207：93-100

［2］徐志文，孟永宏，周志奇，等.一種利用脂肪酶水解油脂生產(chǎn)脂肪酸的方法：CN 101294170［P］.2008-10-29

［3］ 吳瓊，代永剛，鄒險(xiǎn)峰.響應(yīng)面法優(yōu)化脂肪酶水解大豆油工藝［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2012（6）：62-64

［4］向小樂(lè)，黃群，楊萬(wàn)根，等.超聲波輔助脂肪酶水解茶葉籽油條件的優(yōu)化與動(dòng)力學(xué)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（2）：141-146

［5］陳秀菊，彭捷，白新鵬，等.椰子油在溫度梯度場(chǎng)中定向結(jié)晶動(dòng)力學(xué)［J］.食品科學(xué)，2014，35（17）：17-21

［6］Marina A M，Man Y B C，Amin I.Virgin coconut oil：emerging functional food oil［J］.Trends in Food Science&Technology，2009，20（10）481-487

［7］劉小琴.原生態(tài)椰子油熔融分提及物性研究［D］.?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2012

［8］金文飚.脂肪酶在油脂工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品科技，2005（7）：13-15

［9］Phuah E T，Lai O M，Choong S Y，et al.Kinetic study on partial hydrolysis of palm oil catalyzed by Rhizomucor miehei lipase［J］.Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic，2012，78：91-97

［10］梁準(zhǔn)成，楊繼國(guó)，劉冬蘄，等.月桂酸衍生物的合成與抑菌性的比較研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2015，31（3）：84-90

［11］趙國(guó)志，劉喜亮，劉智峰.中碳鏈脂肪酸甘油酯研究概況中碳鏈脂肪酸甘油酯的應(yīng)用［J］.糧油加工與食品機(jī)械，2005（4）：19-21

［12］羅春燕.中碳鏈脂肪酸類食品添加劑的制備及性能研究 ［D］.南昌：南昌大學(xué)，2011

［13］周星.中碳鏈脂肪酸聚甘油酯的制備和性能研究［D］.南昌：南昌大學(xué)，2012

［14］Lencki R W，Smink N，Snelting H，et al.Increasing short-chain fatty acid yield during lipase hydrolysis of a butterfat fraction with periodic aqueous extraction［J］.Journal of Oil&Fat Industries，1999，75 （9）：1195-1200

［15］Chua L S，Alitabarimansor M，Lee C T，et al.Hydrolysis of virgin coconut oil using immobilized lipase in a batch reactor［J］.Enzyme Research，2012，2012：DOI：10.1155/2012/542589

Kinetic Modeling of Enzymatic Hydrolysis of Coconut Oil with Lipase

WU Lin-he，BAI Xin-peng*，WU Qian，XU Xiao-meng，MA Ruo-ying，LI Xue
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

coconut oil；lipase；hydrolysis；enzymatic kinetics

2012-05-09

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31160325）；海南省自然科學(xué)基金（20153159）；海南省自然科學(xué)基金（314075）；海南省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目（Hnky2016ZD-1）

武林賀（1988—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

白新鵬（1963—），男，教授，博士。的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此利用脂肪酶水解椰子油來(lái)生產(chǎn)其衍生物的研究具有重要意義。本文對(duì)脂肪酶水解椰子油的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了研究，考察了底物的質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間等工藝條件對(duì)椰子油水解速率的影響，建立動(dòng)力學(xué)模型，以期為今后產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)椰子油衍生物產(chǎn)品提供理論模型［15］。