鄧玉杰，馬雪蕾，張凱婷，王　瑞，武　運，張珍珍

新疆不同地區(qū)生產(chǎn)的葡萄酒中八種生物胺含量的測定

鄧玉杰，馬雪蕾，張凱婷，王瑞，武運，張珍珍*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）技術(shù)，以丹磺酰氯作為柱前衍生試劑，測定了新疆不同地區(qū)21個市售葡萄酒中的8種生物胺含量。結(jié)果表明，不同地區(qū)葡萄酒中的生物胺總含量存在明顯差異，和田地區(qū)葡萄酒中總生物胺含量最少，為37.16 mg/L，吐魯番地區(qū)葡萄酒中生物胺總含量最高，為335.18 mg/L，且不同地區(qū)生產(chǎn)的葡萄酒中各項生物胺種類也存在差異，生物胺中含量最高的是精胺，平均測定含量為87.37 mg/L。通過對葡萄酒中生物胺含量的測定分析，可以為新疆地區(qū)葡萄酒中的生物胺的安全品質(zhì)控制提供依據(jù)。

葡萄酒；不同地區(qū)；生物胺；測定

葡萄酒是用破碎或未破碎的新鮮葡萄果實或葡萄汁為原料經(jīng)完全或者部分酒精發(fā)酵后獲得酒精度不低于7%vol的發(fā)酵型酒精飲料［1］。葡萄酒中富含很多種類的氨基酸，它們在乳酸菌產(chǎn)生的脫羧酶作用下從而生成組胺、精胺、腐胺、尸胺及苯乙胺等多種生物胺，其中葡萄酒中主要的生物胺為精胺、組胺以及腐胺，甲胺、乙胺、尸胺、苯乙胺和異戊胺等胺類物質(zhì)存在于發(fā)酵前的葡萄原汁中，但是酵母菌等某些微生物在發(fā)酵過程之中可以把一部分的生物胺降解［2］；當(dāng)葡萄酒酒精發(fā)酵時期處在以酵母菌為主導(dǎo)時，含量最高的即為釀酒酵母菌株體內(nèi)的胍基丁胺和乙醇胺，在葡萄酒蘋果酸乳酸發(fā)酵時期，酪胺、組胺、腐胺等生物胺是乳酸菌將氨基酸脫羧而成［3］，除此之外，還含有尸胺及苯乙胺等其他種類的生物胺存在于蘋果酸乳酸發(fā)酵后的葡萄酒中。在對葡萄酒中發(fā)酵過程的生物胺的含量測定結(jié)果表明，在酒精發(fā)酵過后葡萄酒中的生物胺含量很低，但在經(jīng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵后，葡萄酒中生物胺的含量發(fā)生不同程度的增高［4-5］。

生物胺具有特定的生物活性［6］，是雜環(huán)類或一類脂肪族的低分子質(zhì)量含氮堿，在動植物和微生物生理活性細(xì)胞中尤為重要，且適量有助于人體正常的生理功能，過量則會對機體的生理產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)，存在致癌風(fēng)險［7］。除此之外，構(gòu)成核酸及荷爾蒙等的前體物質(zhì)也是生物胺，并且生物活性細(xì)胞不可或缺的組成部分其中就是腐胺、精胺、亞精胺和尸胺，它們不僅可以調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成，在生物膜穩(wěn)定性方面同樣也發(fā)揮著重要作用［8］，而且一些致癌物質(zhì)和亞硝基化合物的前體生成物質(zhì)也是生物胺。大多數(shù)食物中的生物胺可能對人的機體有一定的不良影響，如芳香族生物胺（酪胺和苯乙胺等），可引起偏頭痛和高血壓［9-10］，其中組胺為危害性最大的生物胺，許多國家已經(jīng)作出了葡萄酒中組胺的限量范圍。澳大利亞、匈牙利和瑞士規(guī)定≤10mg/L，法國規(guī)定≤8mg/L，荷蘭規(guī)定≤3.5 mg/L，比利時規(guī)定≤5～6 mg/L，德國規(guī)定≤2 mg/L。目前，其檢測和分析方法包括生物傳感器、薄層色譜（thin-layerchromatography，TCL）、毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophore-sis，CE）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法，其中HPLC具有分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確的特點，是目前食品中生物胺含量分析測定的主要手段［11］。

本實驗主要采用反相高效液相色譜法（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）測定新疆不同區(qū)域和類型的葡萄酒中生物胺種類及含量，獲得新疆產(chǎn)區(qū)葡萄酒中生物胺種類及含量普查數(shù)據(jù)，以期為葡萄酒中生物胺的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

不同地區(qū)的干紅葡萄酒：市售；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；組胺、酪胺、尸胺、乙胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、腐胺和丹磺酰氯：美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

1200Series高效液相色譜儀（紫外檢測器）：美國Agient公司；D2155W離心機、MS 3渦旋混勻器：美國Merck公司；DHG-9053A恒溫培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；FA2004分析天平：上海天平儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

分別稱取生物胺各10 mg，用0.l mg/L HC1溶液溶解并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，用0.l mg/L的HC1溶液定容，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前，根?jù)實驗需要將此標(biāo)準(zhǔn)貯備液用0.1 mg/L HC1溶液配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的配制

分別吸取1.00 mL各生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于同一個10 mL容量瓶中，用0.1 mg/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，配制成生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液（100 mg/L）。

1.3.3生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液（100 mg/L），分別置于10 mL容量瓶中，用0.10 mg/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，使其質(zhì)量濃度分別為1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0mg/L、50.0 mg/L。

1.3.4樣品前處理和衍生

試樣提?。喝∑咸丫?0mL向其加入0.2mL（100 mg/L）的內(nèi)標(biāo)使用液，再向其中加入NaCl至飽和，移取飽和后的試樣提取液5 mL，置于15 mL離心管中，后用0.1 mg/L的NaOH將其pH值調(diào)節(jié)為12，萃取時用5mL正丁醇-氯仿（1∶1，V/V）的溶液提取，再進行旋渦振動5 min，以3 600 r/min的速度再進行10 min的離心。吸取上層有機相后再用等體積的萃取液進行2次提取，合并萃取液后混勻，取3 mL萃取液，加入0.2 mL 1 mg/L鹽酸，混合后40℃水浴條件下用氮氣吹干，再加入1 mL 0.1 mg/L鹽酸溶解殘留物，待衍生。

取0.5 mL樣品提取液，置10 mL具塞試管中，加入1.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液、1.0 mL（5 mg mL丙酮）衍生劑，混合振蕩。置60℃條件下反應(yīng)30 min（中間振蕩兩次），取出后加入100 μL谷氨酸鈉（50 mg/L飽和碳酸氫鈉溶液），振蕩，60℃條件下保溫15 min。取出每個試管中加入1 mL超純水，40℃水浴下，用氮氣除去丙酮。加入3 mL乙醚，旋渦振蕩器上混合振蕩2 min，靜置，分層后取上層有機相（乙醚層），加重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃水浴條件下氮氣吹干。加1.0 mL甲醇溶解殘留物，振蕩混合，過0.22 μm（0.45 μm）微孔濾膜，濾液可直接進HPLC測定。

1.3.5高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30℃，紫外檢測波長為254 nm，A相為甲醇，B相為超純水進行梯度洗脫，流速：1.5 mL/min，進樣量為20 μL，以峰面積內(nèi)標(biāo)法定量，梯度洗脫條件見表1。

表1　梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

2　結(jié)果與分析

2.1生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品及樣品的測定

由于分子中缺少發(fā)色基團，既無熒光和電化學(xué)活性，本身又無紫外吸收，所以只能檢測到衍生后的生物胺。丹磺酰氯作為比較穩(wěn)定的衍生物，同時具有特異的紫外吸收和熒光響應(yīng)，而且采用其衍生獲得的檢測結(jié)果較為理想［12］。生物胺標(biāo)準(zhǔn)品及葡萄酒樣品的高效液相色譜圖如圖1所示。

由圖1A可知，8種生物胺混標(biāo)組分在30 min內(nèi)得到了一個很好的分離效果，其出峰順序為精胺4.50 min，色胺14.84 min，苯乙胺17.83 min，腐胺20.41 min，尸胺22.74min，組胺25.68min，酪胺27.69min，亞精胺28.36 min。由圖1B可知，葡萄酒樣品中生物胺組分出峰順序為精胺4.50 min，色胺13.80 min，苯乙胺18.09 min，腐胺20.42 min，尸胺22.82 min，組胺25.71 min，酪胺27.69 min，亞精胺28.36 min。

圖1　8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（A）及葡萄酒樣品（B）的高效液相檢測色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of eight biogenic amines standard substance（A）and wine sample（B）

2.2不同地區(qū)葡萄酒中生物胺總量的測定

分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)系列和試樣的衍生溶液注入高效液相色譜儀中，測定，記錄色譜圖，計算各生物胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積比，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以各生物胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程再計算試樣中的生物胺含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2　新疆不同地區(qū)葡萄酒中生物胺總含量Fig.2 Total contents of biogenic amines in wine from Xinjiang different regions

由圖2可知，不同地區(qū)葡萄酒中生物胺含量存在明顯差異，樣品葡萄酒中生物胺含量在37～327 mg/L范圍，伊犁不同地區(qū)總生物胺含量相對均勻，吐魯番地區(qū)的總生物胺含量相比其他地區(qū)較高，昌吉兩地的生物胺含量相差較大，其他地區(qū)總生物胺含量也存在明顯差異，說明生物胺的生成是一個復(fù)雜的過程，在葡萄酒的發(fā)酵過程中與酵母菌及乳酸菌的作用有很大關(guān)系且葡萄酒中氨基酸含量、發(fā)酵工藝以及發(fā)酵車間衛(wèi)生條件等都影響著葡萄酒中氨基酸向生物胺及高級醇的轉(zhuǎn)化，葡萄酒在釀造時加入氨基酸的也會影響生物胺的生成。

2.3各地區(qū)不同生物胺組分含量的測定

新疆不同地區(qū)葡萄酒中精胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、組胺、色胺、腐胺含量測定結(jié)果如圖3所示。

圖3　新疆不同地區(qū)葡萄酒中各生物胺組分含量Fig.3 Component contents of biogenic amines in Xinjiang different regions

由圖3可知，新疆不同地區(qū)葡萄酒中精胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、組胺、色胺、腐胺都有檢出，并且有所差異。葡萄酒中組胺含量波動范圍在2.00～9.74 mg/L，其中大部分地區(qū)組胺含量在平均值4.19 mg/L左右，其中伊犁-2和吐魯番-4號樣品中含量偏高。精胺含量波動范圍在28.63～218.38 mg/L，相比其他生物胺，精胺在葡萄酒樣品中的含量最高，說明精胺是葡萄酒發(fā)酵后的主要生物胺，其前體物質(zhì)是精氨酸［13-16］。亞精胺波動范圍在0.88～4.17 mg/L，其中最高和最低的兩地區(qū)亞精胺含量相差3.29 mg/L，由于亞精胺含量不高，且各地區(qū)相差也不是很大，說明現(xiàn)有的亞精胺控制技術(shù)已經(jīng)很成熟。酪胺波動范圍在1.71～7.24 mg/L，酪胺含量除個別地區(qū)高于平均值外，其他地區(qū)酪胺含量在3.00 mg/L左右。苯乙胺含量波動范圍0.69～4.50 mg/L，吐魯番地區(qū)苯乙胺的含量相對較均勻，阜康和哈密地區(qū)的苯乙胺含量存在明顯差異，可能是加工過程中某些工藝或處理不相同造成的。尸胺除了阜-1沒有檢出外，其他地區(qū)都有檢出，其含量波動范圍在0.02～2.32mg/L，相比其他生物胺而言，尸胺是葡萄酒樣品中含量是最少的生物胺。色胺含量波動范圍在0.41～6.14 mg/L，其中瑪納斯地區(qū)的色胺含量遠遠高于其他地區(qū)的。腐胺含量波動范圍在0.07～83.13 mg/L，其波動范圍比較大，說明腐胺是可以在生產(chǎn)過程中加以控制并減少的生物胺。

3　結(jié)論

本實驗按照國標(biāo)GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測定》中方法測定了20個地區(qū)市售葡萄酒中的生物胺含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)的總生物胺存在明顯差異，即使是同一產(chǎn)區(qū)葡萄酒中生物胺含量也可能存在較大的差異，說明在釀酒過程中生物胺的產(chǎn)生很復(fù)雜的，同時發(fā)現(xiàn)一些產(chǎn)區(qū)中的生物胺含量較低，說明可以對葡萄酒的一些生產(chǎn)工藝加以調(diào)控，來減少葡萄酒中的生物胺含量，以此來降低生物胺對人體的危害。

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Determination of eight kinds of biogenic amines content in wine from Xinjiang different regions

DENG Yujie，MA Xuelei，ZHANG Kaiting，WANG Rui，WU Yun，ZHANG Zhenzhen*
（College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830000，China）

Using dansyl chloride as pre-column derivation agents，eight kinds of biogenic amines content in wine from 21 regions in Xinjiang was determined by reverse phase high phase liquid chromatography（RP-HPLC）.The results showed that the total content of biogenic amines in wine from differentregionswassignificantdifference.Thetotalcontentofbiogenicaminesin wine fromHotan region wasthe least（37.16 mg/L），and the totalcontent of biogenic amines in wine from Turpan region was the highest（335.18 mg/L）.The types of biogenic amines in wine from different regions were also difference.Spermine content was the highest in biogenic amines，and the average content was 87.37 mg/L.By determination and analysis of biogenic amines content，it could provide the basis for safety and quality of biogenic amines in wine of Xinjiang regions.

wine；different region；biogenic amines；determination

N34

0254-5071（2016）07-0171-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.037

2016-04-06

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱濏椖浚╔JEDU2014S019）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201510758006）

鄧玉杰（1991-），女，本科生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

張珍珍（1984-），女，副教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。