梁桂娟，尋思穎，張　瓊，李紅洲

LC-MS/MS法測定食用油中的辣椒素和二氫辣椒素

梁桂娟，尋思穎*，張瓊，李紅洲

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，貴州 貴陽 550016）

建立了用氨基固相萃取小柱凈化提取液，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定食用油中辣椒素和二氫辣椒素含量的檢測方法。結(jié)果表明，辣椒素在0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 6），平均回收率在70.6%～90.5%，相對標準偏差（RSD，n=3）在3.1%～8.9%，檢出限為0.03 μg/kg；二氫辣椒素在0～20 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 8），平均回收率在71.5%～100.7%，相對標準偏差（RSD，n=3）在6.0%～13.2%，檢出限為0.006 μg/kg。該方法簡便快速、準確可靠，是鑒別地溝油和測定食用油中辣椒素類物質(zhì)的有效方法。

固相萃??；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；食用油；辣椒素；二氫辣椒素

正常食用油中幾乎不含辣椒素類物質(zhì)，但一些不法商販為獲取暴利，把地溝油添加到正常食用油中，以假亂真。地溝油是各類廢棄劣質(zhì)油脂的統(tǒng)稱［1］，其中來自餐飲業(yè)的泔水油是其主要成分，也包括煎炸廢油、食品及相關(guān)企業(yè)產(chǎn)生的廢棄油脂等。地溝油含有多種有害成分，長期食用易對人體產(chǎn)生巨大的傷害［2］，其鑒別及有效的檢測方法已成為我國食品安全領(lǐng)域亟須解決的問題。由于我國居民的飲食習(xí)慣，辣椒是餐飲業(yè)中使用量較大的調(diào)味料，而辣椒的主要辣味成分是天然辣椒堿，該物質(zhì)由14種辣椒素同位素組成，其中辣椒素和二氫辣椒素的總含量占辣椒堿的90%以上［3］。辣椒素類物質(zhì)具有脂溶性強、穩(wěn)定性好、沸點高等特點，目前的地溝油加工工藝很難完全除去這類物質(zhì)，而接觸過辣椒的餐廚廢棄油脂幾乎難免含有這種成分，因此可將辣椒素類物質(zhì)作為鑒別餐廚廢棄油脂的特征指標［4-6］。

我國國家標準［7-9］中及文獻方法［10］檢測辣椒素類物質(zhì)的方法主要是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和分光光度法，適用于辣椒或以辣椒為主要原料的辣椒制品進行常量或微量的定量檢測，檢出量一般為g/kg級，最低檢出限均為mg/kg。由于地溝油在經(jīng)過水洗、蒸餾、脫色、除臭等加工處理，且不法商販將之以一定比例滲入正常食用油后，大大降低了油脂中殘留的辣椒素類物質(zhì)的含量，因此常量檢測方法很難將其檢測出來。文獻報道了幾種用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測油脂中辣椒素類物質(zhì)的方法［11-15］，檢出限均能達到μg/kg級甚至ng/kg級，用于地溝油的鑒別分析，均取得了良好效果。王龍星等［11-12］利用辣椒素類物質(zhì)含有酚羥基的特征，先用堿液萃取油脂中的辣椒素類物質(zhì)，再將萃取液過HLB固相萃取小柱進行凈化，該方法能有效除去油脂基質(zhì)，但操作過程較為繁瑣耗時，實驗結(jié)果穩(wěn)定性不理想。張忠等［13］用甲醇提取油脂中的辣椒素類物質(zhì)后直接進液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測，雖然簡單快速，但不能有效除去油脂基質(zhì)，容易污染儀器，且檢出限較高。趙琴等［14］采用Benzo I填料作為吸附劑，利用辣椒素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有極性較強的酚羥基和酰胺基團，在非極性環(huán)境中能保留在吸附劑上的特點，一步凈化提取液，不僅能有效除去油脂基質(zhì)，且操作簡便易行，但裝填吸附劑費時費力，且是否裝填均勻?qū)嶒灲Y(jié)果影響很大，不適合大批量的樣品檢測。

本實驗在參考相關(guān)文獻及反復(fù)實驗的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法測定食用油中辣椒素和二氫辣椒素含量，選擇具有極性固定相和弱陰離子交換劑雙重作用的硅膠氨基萃取柱Classic-NH2作為固相萃取小柱凈化提取液，用甲醇洗脫目標物及空白基質(zhì)加標溶液配制標準曲線并用二苯胺做內(nèi)標，以補償基質(zhì)效應(yīng)及校正儀器波動引起的測定誤差。該方法的建立，將有效提升檢測辣椒素和二氫辣椒素的技術(shù)水平，為地溝油的綜合判定提供可靠的技術(shù)保證。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

色拉油：市售；辣椒素標準品（純度＞98%，分子式C18H27NO3，CAS號：404-86-4）：南京多隆生物科技有限公司；二氫辣椒素（純度＞98%，分子式C18H29NO3，CAS號：19408-84-5）：上海樊克生物科技有限公司；二苯胺標準品（純度＞99%，分子式C12H11N，CAS：122-39-4）：上海常斤生物科技有限公司；0.22 μL有機濾膜：上海澤孚實業(yè)有限公司。

甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷（均為分析純）：天津市津東天正精細化學(xué)試劑廠；甲醇、甲酸（色譜純）：美國默克公司；Classic-NH2陰離子交換固相萃取小柱（規(guī)格1 000 mg/6 mL）：德國Simon Aldrich公司，使用前用5 mL甲醇、3 mL丙酮和3 mL正已烷依次活化。

1.2儀器與設(shè)備

YP202N型電子天平（感量0.01 g）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AB4000Qtrap液質(zhì)聯(lián)用儀（帶Agilent1260高效液相色譜儀）：美國AB公司；Mnltireax振蕩混勻器：Heielolph公司；TurboVap氮吹儀：美國Biotage公司；固相萃取裝置：美國Agilent公司。DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；90-2磁力攪拌器：上海振榮科學(xué)儀器有限公司；QL-901漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1質(zhì)譜條件

根據(jù)辣椒素、二氫辣椒素及二苯胺的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI（+）正離子電離模式。通過對幾種物質(zhì)的標準溶液進行一級質(zhì)譜全掃描和二級質(zhì)譜掃描，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量和其他參數(shù)，最終確定優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為：霧化溫度650℃；氣簾氣（氮氣）流量：35 L/h；噴霧電壓500 V；霧化氣流量60 L/h；輔助氣流量60 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測（multiplereaction monitoring，MRM）模式質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　辣椒素、二氫辣椒素及二苯胺的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectra parameters of capsaicin，dihydrocapsaicin and diphenylamine

1.3.2高效液相色譜條件

Agilent SB C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，4.6 μm）；流速0.8 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；流動相為0.1%甲酸水溶液和甲醇溶液梯度洗脫，洗脫梯度程序見表2。

表2　流動相梯度洗脫參數(shù)Table 2 Gradient elution parameters of mobile phase

1.3.3樣品前處理

提?。悍Q取2.5 g樣品（精確至0.01 g），加入10 mL正己烷，在渦旋混勻器上充分混勻后作為上樣液待凈化。

凈化：將上樣液全部吸入經(jīng)活化后的固相萃取小柱，殘留樣液用正己烷清洗后并入固相萃取小柱，流速不超過1.0 mL/min。上樣液全部過柱后，先用5 mL含體積分數(shù)為20%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗小柱，再用5～10 mL含體積分數(shù)為80%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗，抽干淋洗液，用4 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液用氮吹儀于40℃條件下吹干，最后用1 mL質(zhì)量濃度為5 μg/L的二苯胺甲醇溶液充分渦旋混勻，過0.22 μm微孔有機濾膜供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.3.4標準溶液的制備

（1）辣椒素和二氫辣椒素標準儲備液

準確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）辣椒素標準品和二氫辣椒素標準品，用甲醇溶解后定容至100 mL，配制成1 mg/mL的標準儲備溶液，于-20℃條件下保存。

（2）二苯胺內(nèi)標儲備液

準確稱取10 mg二苯胺標準品，用甲醇溶解后定容至100mL，配制成100μg/mL的內(nèi)標儲備溶液，于-20℃條件下保存。臨用時用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為5μg/L的內(nèi)標使用液。

（3）混合標準使用溶液的配制

移取不同體積的辣椒素、二氫辣椒素和二苯胺儲備液，用甲醇配制成辣椒素質(zhì)量濃度為0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5μg/L、10.0μg/L、25.0μg/L、50.0 μg/L、100.0μg/L，二氫辣椒素質(zhì)量濃度為0.02 μg/L、0.10 μg/L、0.50 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L、20.00 μg/L，二苯胺質(zhì)量濃度為5 μg/L的混合標準使用溶液。

（4）空白基質(zhì)混合標準使用液

分別稱取與待測樣品基質(zhì)相同的、不含所測辣椒素和二氫辣椒素的陰性油脂樣品7份于50 mL具塞離心管中。經(jīng)過樣液提取和凈化步驟，分別加入1 mL混合標準使用溶液，渦旋混勻，配制成上述質(zhì)量濃度的空白基質(zhì)混合標準系列使用液。

1.3.5定性定量方法

1.4.2 治療因素：治療有效是支持診斷的重要依據(jù)。而診斷性治療(試驗性治療)更是鑒別診斷的常用方法。但即使治療方案是合理的，療效也不可能百分之百。而治療引起的不良反應(yīng)以及藥物對癥狀體征和輔助檢查結(jié)果的影響都會干擾診斷[3]。

本方法用保留時間及離子對對目標化合物進行定性，二苯胺內(nèi)標法定量。其中，標準溶液與待測溶液的保留時間偏差在2.5%以內(nèi)。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品前處理方法

2.1.1提取及凈化方法

采用正己烷溶解油脂，直接上Classic-NH2柱進行凈化。Classic-NH2是一種以硅膠為基質(zhì)的氨基萃取柱。它具有極性固定相和弱陰離子交換劑，可通過弱陰離子交換（水溶液）或極性吸附（非極性有機溶液）達到保留作用，具有雙重作用。當(dāng)用在非極性溶液中（如正已烷）進行預(yù)處理時，它能與帶有-OH、-NH、-SH官能團的分子形成氫鍵。辣椒素和二氫辣椒素具有較強的脂溶性，易溶于正己烷等非極性有機溶劑，同時分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基和酰胺基等極性基團，可以保留在Classic-NH2柱上，因此，用正己烷溶解含有辣椒素類物質(zhì)的油脂時，可形成穩(wěn)定均勻的非極性有機溶液，當(dāng)溶液流過Classic-NH2時，含有-OH、-NH的辣椒素類物質(zhì)保留在柱上，而油脂及其余雜質(zhì)則流出小柱，用不同體積分數(shù)的乙酸乙酯正己烷溶液充分淋洗殘留在柱上的殘留油脂和其他雜質(zhì)后，再用甲醇洗脫保留在柱上的辣椒素和二氫辣椒素，濃縮后進行檢測。這種前處理方法利用辣椒素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)上的特點，可一步提取進行凈化，大大提高了回收率，而且節(jié)約了有機溶劑的使用量，縮短了檢測時間。此外，由于無需裝填凈化小柱，保證了填料的均勻性，因此提高了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。

2.1.2淋洗溶液及洗脫液的選擇

為使上機樣液盡可能干凈，減少基質(zhì)效應(yīng)和對儀器的污染，本實驗用不同體積分數(shù)的乙酸乙酯正己烷溶液淋洗上樣后的小柱。實驗發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯體積分數(shù)越高，越容易洗凈殘留在柱上的油脂，考慮到乙酸乙酯對辣椒素類物質(zhì)有一定的洗脫作用［14］，最終選擇用含乙酸乙酯體積分數(shù)分別為20%和80%的正己烷溶液各5 mL依次淋洗。

用常用的兩種洗脫試劑甲醇和乙腈進行實驗，發(fā)現(xiàn)用甲醇作洗脫劑時，辣椒素和二氫辣椒素的洗脫率均高于乙腈，這可能是因為辣椒素類物質(zhì)主要是通過氫鍵作用保留在固相萃取小柱上，而甲醇的分子結(jié)構(gòu)中含有-OH，根據(jù)相似相溶原理，因此甲醇更容易洗脫目標物質(zhì)。

2.2定量方法及內(nèi)標的選擇

在色譜-質(zhì)譜分析中，由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，目標物在純?nèi)軇┖蜆悠诽幚硪褐械捻憫?yīng)有較大差異，同時，在前處理過程中目標物會有不同程度的損失。為更真實地反映實際樣品中目標物的含量，一般會在樣品中加入該目標物的同位素內(nèi)標進行校正及補償。但辣椒素及二氫辣椒素的內(nèi)標物較昂貴，檢測成本高，不利于方法的普及。因此，本實驗采用空白基質(zhì)加標的方式配制標準曲線，并用保留時間與二者接近的二苯胺作內(nèi)標，以校正儀器波動實驗引起的誤差。結(jié)果表明，用這種方法進行定量，回收率及實測結(jié)果均有明顯提高。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

對空白基質(zhì)混合標準系列溶液進樣測定，以峰面積（y）為縱坐標，辣椒素和二氫辣椒素含量（x）為橫坐標進行線性回歸，得標準線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比3∶1計算檢出限，得辣椒素和二氫辣椒素的最低檢測質(zhì)量濃度分別為0.076 μg/L和0.015 μg/L，按本實驗中的取樣量和定容體積計算，則樣品中的檢出限分別為0.03 μg/kg和0.006 μg/kg。線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（detection limit，LOD）見表3，添加目標物的油脂樣品的MRM色譜及質(zhì)譜圖見圖1～圖3。

表3　方法的線性參數(shù)、檢出限Table 3 Linear parameters and detection limit of the method

圖1　辣椒素、二氫辣椒素、二苯胺的LC-MS/MS色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatogram of capsaicin，dihydrocapsaicin and diphenylamine

圖2　辣椒素MRM的色譜圖（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.2 MRM chromatogram（A）and mass spectra（B）of capsaicin

圖3　二氫辣椒素MRM的色譜圖（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.3 MRM chromatogram（A）and mass spectra（B）of dihydrocapsaicin

2.3.2回收率實驗

在空白油脂樣品中添加低（辣椒素和二氫辣椒素分別為0.25 μg/kg和0.05 μg/kg）、中（辣椒素和二氫辣椒素分別為2.5 μg/kg和0.5 μg/kg）、高（辣椒素和二氫辣椒素分別為25 μg/kg和5 μg/kg）三個濃度的目標分析物，每個濃度平行測定3次，進行加標回收實驗，結(jié)果見表4。

表4　加標回收率實驗結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rate experiments

由表4可知，辣椒素的平均回收率在70.6%～90.5%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在3.1%～8.9%，二氫辣椒素的平均回收率在71.5%～100.7%，相對標準偏差（RSD）在6.0%～13.2%，表明本方法準確性好。

2.3.3重現(xiàn)性實驗

由兩名檢測人員在不同時間測定同一加標樣品，辣椒素加標量為1.0 μg/kg，二氫辣椒素加標量為0.2 μg/kg，每人重復(fù)測定3次，考察該方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表5。

由表5可知，重現(xiàn)性實驗結(jié)果RSD在3.5%～6.8%，表明重現(xiàn)性良好，方法穩(wěn)定。

2.4樣品的測定

表6　食用油中辣椒素和二氫辣椒素的檢測結(jié)果Table 6 Detection results of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil

用本方法對市場上6種知名品牌各類食用油進行檢測，均未檢出辣椒素及二氫辣椒素。為驗證方法的適用性，在上述食用油中加入已知辣椒素和二氫辣椒素含量分別為1.92 mg/kg和0.73 mg/kg的辣椒油，以5∶95的比例混勻后按本方法檢測，結(jié)果（見表6）可知，實測值與理論值標準偏差在4.5%～16.6%，說明本方法具有較好的適用性。

3　結(jié)論

本研究建立了固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測定食用油中辣椒素和二氫辣椒素含量的方法。樣品用正己烷溶解后，上Classic-NH2硅膠氨基固相萃取小柱凈化，最后用液質(zhì)聯(lián)用儀對樣液中的辣椒素和二氫辣椒素進行檢測。結(jié)果表明，辣椒素在0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 6）平均回收率在70.6%～90.5%，相對標準偏差（RSD，n=3）在3.1%～8.9%，檢出限為0.03μg/kg；二氫辣椒素在0～20ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 8），平均回收率在71.5%～100.7%，相對標準偏差（RSD，n=3）在6.0%～13.2%，檢出限為0.006 μg/kg。本方法操作簡便快速、準確可靠、適用性好，檢出限可達ng/kg級，是鑒別地溝油或食用油中是否滲雜地溝油的有效方法。

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Determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil by LC-MS/MS

LIANG Guijuan，XUN Siying*，ZHANG Qiong，LI Hongzhou
（Guizhou Institute of Product Quality Supervision and Determination，Guiyang 550016，China）

A method was established for the determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil by solid phase extraction and LC-MS/MS. Theresultsindicatedthatthecapsaicinshowedgoodlinearrelationshipintherangeof 0-100ng/ml（R2=0.9986），theaveragerecoverywas70.6%-90.5%，and relative standard deviation（RSD，n=3）was 3.1%-8.9%，and the detection limit was 0.03 μg/kg.The dihydrocapsaicin showed good linear relationship in the range of 0-20 ng/ml（R2=0.998 8），the average recovery was 71.5%-100.7%，relative standard deviation（RSD，n=3）was 6.0%-13.2%，and the detection limit was 0.006 μg/kg.The method was simple，rapid，accurate and reliable，and it was an effective method for the identification of waste oil and determination of capsaicin in edible oil.

solid phase extraction；LC-MS/MS；edible oil；capsaicin；dihydrocapsaicin

O657.72

0254-5071（2016）07-0175-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.038

2016-05-24

貴州辣椒技術(shù)標準體系（黔衛(wèi)計辦函［2015］94號）

梁桂娟（1972-），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品分析與檢測。

尋思穎（1963-），女，研究員，本科，研究方向為食品安全風(fēng)險評價。