車坷科，劉　鑫，卿尚蘭，張熙承

(重慶市人民醫(yī)院：1.藥學(xué)部；2.口腔科　400014)

?

丙氨酰谷氨酰胺對(duì)體外培養(yǎng)人頰黏膜成纖維細(xì)胞生物活性的影響研究*

車坷科1，劉鑫2△，卿尚蘭2，張熙承2

(重慶市人民醫(yī)院：1.藥學(xué)部；2.口腔科400014)

目的研究丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)溶液對(duì)體外培養(yǎng)的人頰黏膜成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、蛋白合成和堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(N組)、Ala-Gln組(A組)和Gln組(G組)，A、G組各設(shè)推薦濃度的8、4、2、1、1/2、1/4和1/8倍7個(gè)梯度濃度，在體外培養(yǎng)的人頰黏膜成纖維細(xì)胞中分別加入上述各組溶液。培養(yǎng)至12、24、36、48、60和72 h，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；用酶聯(lián)免疫檢測(cè)對(duì)應(yīng)時(shí)段各自ALP水平，72 h時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白水平。結(jié)果N組在72 h內(nèi)細(xì)胞數(shù)量并未明顯變化，ALP水平隨著時(shí)間推移有所增加，但變化幅度小于A、G組(P<0.05)；A、G組在24 h以內(nèi)都能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，ALP的水平也明顯提高(P<0.05)，且以1/2倍推薦濃度組最為顯著；各藥物濃度組細(xì)胞蛋白水平均高于N組(P<0.05)。結(jié)論Ala-Gln能促進(jìn)頰黏膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，濃度過高或過低可影響細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，以1/2倍推薦濃度(即Ala-Gln濃度為16.5 mg/mL)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)情況最好。

口腔黏膜；成纖維細(xì)胞；堿性磷酸酶；丙氨酰谷氨酰胺；細(xì)胞生長(zhǎng)

口腔復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU)是最常見的口腔黏膜病，是以口腔黏膜自發(fā)性、復(fù)發(fā)性潰瘍?yōu)樘攸c(diǎn)的一種疾病，普通人群的發(fā)病率為20%左右；RAU的局部治療目前以消炎、止痛、防止繼發(fā)感染、促進(jìn)愈合為原則[1]。谷氨酰胺(Glutamine，Gln)是免疫細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等快速增殖細(xì)胞的主要能量來源[2]，除了具有增加葡萄糖胺、氨基己糖、黏蛋白的生物合成和促進(jìn)潰瘍組織再生等生物活性外，還具有有效調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、改善機(jī)體代謝狀況、提高機(jī)體抗氧化能力等藥理作用[3-4]。由于Gln在水溶液中溶解度低且不穩(wěn)定[5]，目前臨床使用具有化學(xué)穩(wěn)定性好、水溶性強(qiáng)、能耐受高溫消毒等優(yōu)點(diǎn)的丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)為Gln的供體，通過在細(xì)胞外發(fā)生的水解，為機(jī)體提供穩(wěn)定的Gln[6]。本文就Ala-Gln對(duì)體外培養(yǎng)的人頰黏膜成纖維細(xì)胞(fibroblast)的生長(zhǎng)、蛋白合成和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性進(jìn)行研究，并與對(duì)應(yīng)含量的Gln進(jìn)行對(duì)比，以期為Ala-Gln治療RAU的臨床研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來源標(biāo)本采自重慶市人民醫(yī)院口腔科在頰黏膜取送活檢的組織中的正常組織，均征得患者本人及其家屬同意并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器Ala-Gln(重慶萊美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)F151210)，Gln(武漢千潤(rùn)生物工程有限公司贈(zèng)送，批號(hào)140618)，D-Hanks緩沖液(自配，含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)；DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶、優(yōu)等胎牛血清(FBS)和Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)MPBIO公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國(guó)Amresco公司)；二氧化碳細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma Scientic公司)；CKC-TR-2W型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(芬蘭Labsystems dragon MK3公司)；YJ-875型超凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；96孔培養(yǎng)板(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；波形絲蛋白、角蛋白一抗及即用型SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海美季生物有限公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物公司)。

1.2方法

1.2.1人頰黏膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、分離純化及鑒定[7-8]無菌條件下取出頰黏膜組織，剔除壞死組織及血漬，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，青霉素、鏈霉素浸泡0.5 min，PBS沖洗2次，剪成約0.5 mm×0.5 mm，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃孵箱消化30 min，加入0.2% Ⅰ型膠原酶振蕩消化30～60 min，至組織完全溶解，用含10% FBS的DMEM等體積中和，200目過濾，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶。于 37 ℃ 5% CO2飽和溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后去除未貼壁細(xì)胞。此后每72小時(shí)換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用機(jī)械刮出法及酶消化法去除成纖維細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時(shí)，用0.25%的胰酶消化，按(4～6)×103/cm2傳代。取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成纖維細(xì)胞，用SABC法進(jìn)行波形蛋白、角蛋白免疫組織化學(xué)染色，鑒定細(xì)胞來源。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理根據(jù)加藥情況，將加入Ala-Gln溶液的定為A組；加入Gln溶液的定為G組；含20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照，定為N組。根據(jù)Ala-Gln產(chǎn)品使用說明書中的推薦濃度，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將Ala-Gln溶液的基礎(chǔ)濃度定為33 mg/mL，折算Gln溶液的基礎(chǔ)濃度為22 mg/mL，然后按加入溶質(zhì)的量共設(shè)立8、4、2、1、1/2、1/4和1/8倍7個(gè)濃度梯度組，分別用A8、A4、A2、A1、A1/2、A1/4、A1/8和G8、G4、G2、G1、G1/2、G1/4、G1/8表示。

Gln溶液的配制方法：按照上述濃度梯度的設(shè)置，稱取Gln原料藥適量，溶于滅菌PBS(pH 7.4)中，超聲助溶，配制好的儲(chǔ)備液于0 ℃冰箱中儲(chǔ)存。Ala-Gln溶液的配制方法同Gln。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)情況的檢測(cè)取第5代傳代的成纖維細(xì)胞，胰蛋白酶消化貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，終止消化后添加15% FBS培養(yǎng)基，用移液管反復(fù)輕輕吹打成單細(xì)胞懸浮液，按1∶3的接種比例傳代培養(yǎng)。將長(zhǎng)好的貼壁細(xì)胞消化后，以細(xì)胞密度為0.75×106/mL轉(zhuǎn)入搖瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞形態(tài)良好，以每瓶100 mL培養(yǎng)基均勻接入250 mL三角瓶中(接種密度為1.0×106/mL)，按照1.2.2項(xiàng)的分組情況加入對(duì)應(yīng)濃度的溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔12 h取樣，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將本實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.4細(xì)胞蛋白水平檢測(cè)細(xì)胞以1×105/mL 的密度接種于96孔板，每孔1.0 mL。血清饑餓12 h后，各濃度組加入96孔板中，每種濃度加6孔；對(duì)照組加含0.5% FBS的DMEM。96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，棄去孔內(nèi)液體，用pH 7.4的PBS沖洗3次，吸干，每孔加入150 μL 0.5% Trton X-100裂解過夜后，取200 μL裂解液按蛋白濃度試劑盒說明用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度值換算成蛋白水平(μg/mL)。

1.2.5細(xì)胞ALP活性檢測(cè)取第5代頰黏膜成纖維細(xì)胞，以1×105/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板，10% DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)4 d，棄孔內(nèi)液體，加入Triton X-100，4 ℃過夜，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：在12、24、36、48、60和72 h時(shí)，取上述各孔液體及空白對(duì)照的蒸餾水一并轉(zhuǎn)入另一個(gè)96孔板。按ALP試劑盒說明依次按比例加入緩沖液、基質(zhì)液，水浴，加入對(duì)硝基苯磷酸二鈉(PNPP)顯色劑后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值，間接反映細(xì)胞ALP活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度值換算成ALP水平(U/mgprot)，并將ALP用蛋白水平進(jìn)行校正。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較用Tamhane′s T2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1體外培養(yǎng)的人頰黏膜成纖維細(xì)胞情況胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。經(jīng)SABC法染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞表現(xiàn)為角蛋白染色陰性，胞質(zhì)不著色，波形絲蛋白染色陽性，細(xì)胞胞質(zhì)棕黃色著色，說明細(xì)胞來源于中胚層，為結(jié)締組織源性細(xì)胞。見圖1～3。

圖1 體外培養(yǎng)的人頰黏膜成纖維細(xì)胞(×40) 圖2 成纖維細(xì)胞波形絲蛋白染色陽性(×100) 圖3 成纖維細(xì)胞角蛋白染色陰性(×100)

2.2細(xì)胞生長(zhǎng)情況N組細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡處于一種平衡，細(xì)胞數(shù)并未明顯變化，在(1.00～1.01)×106/mL；加入兩種藥物后，特別是24 h以內(nèi)，都能明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05)；其中，A8、A4和G8、G4從24 h后，細(xì)胞數(shù)目未明顯變化；48 h后，A2和G2細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)開始逐漸減慢，而A1/8和G1/8細(xì)胞數(shù)目開始下降；60 h后，A1和G1細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)開始逐漸減慢。在整個(gè)72 h內(nèi)，A1/2、A1/4和G1/2、G1/4細(xì)胞數(shù)目都能保持持續(xù)增長(zhǎng)的狀態(tài)，特別是A1/2在72 h時(shí)達(dá)到了4.20×106/mL，為本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最大值；無論是A組或者G組，1/4濃度組的生長(zhǎng)曲線低于1/2濃度組，但A組和G組對(duì)應(yīng)濃度組之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4　各組頰黏膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3細(xì)胞蛋白水平各藥物濃度組細(xì)胞蛋白水平均高于N組(673.68 mg/mL)，A1/2和G1/2細(xì)胞蛋白水平為各自組別最高，分別為1 407.51、1 393.35 mg/mL，而A組和G組同梯度濃度的細(xì)胞蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5　各組頰黏膜成纖維細(xì)胞蛋白水平比較

2.4細(xì)胞ALP活性N組細(xì)胞的ALP水平隨著時(shí)間推移有所增加，但變化幅度不如A、G組明顯，在加入Ala-Gln或Gln后，特別是24 h內(nèi)，ALP的水平顯著提高；其中，A8、A4和G8、G4從24 h后，ALP水平未明顯變化；48 h后，A2和G2 ALP增長(zhǎng)幅度開始逐漸減慢，而A1/8和G1/8 ALP水平開始下降，但仍較N組有顯著升高；60 h后，A1和G1 ALP水平增長(zhǎng)開始逐漸減慢。72 h內(nèi)A1/2、A1/4和G1/2、G1/4 ALP水平都能保持持續(xù)增長(zhǎng)的狀態(tài)，特別A1/2在72 h時(shí)達(dá)到了53.48 U/mgprot；無論是A組或G組，1/4濃度組各時(shí)間點(diǎn)ALP的水平都低于1/2濃度組，但A和G組同梯度濃度組之間，ALP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

圖6　各組頰黏膜成纖維細(xì)胞ALP活性比較

3　討　　論

RAU的治療目前多采用口腔局部用藥[9]，常用的藥物包括生長(zhǎng)因子、中藥制劑、生物制劑、人工合成藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、微量元素補(bǔ)充劑等，但由于病因復(fù)雜、藥物價(jià)格及患者依從性等原因，其療效和推廣應(yīng)用都受到了很大的限制[10]。本研究采用Ala-Gln，從促進(jìn)潰瘍愈合和增強(qiáng)黏膜局部免疫力等方面治療RAU，從而克服目前臨床上RAU治療方面的不足。這一研究方案和初步研究成果已獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)(專利號(hào)ZL 2013 1 0375582.7)。

細(xì)胞增殖是生物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖的基礎(chǔ)，目前常用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖效應(yīng)，但不能較好地反映細(xì)胞活性情況；而流式細(xì)胞儀是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置，可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來，經(jīng)過設(shè)定，可以計(jì)數(shù)活細(xì)胞和檢測(cè)細(xì)胞活力[11]。蛋白水平的變化可反映細(xì)胞功能的活躍程度，細(xì)胞增殖與蛋白合成呈正相關(guān)，活細(xì)胞數(shù)量增加，其蛋白水平也應(yīng)相應(yīng)增多[12]。ALP是參與組織形成、代謝和再生的一種重要物質(zhì)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞分化和成熟的一種指標(biāo)，目前已發(fā)現(xiàn)ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5與ALP6 6種同工酶，而其中ALP5來自上皮和成纖維細(xì)胞[13]，測(cè)定ALP活性可以評(píng)價(jià)細(xì)胞分化情況。因此，本文確定了細(xì)胞總數(shù)、蛋白水平、ALP活性3個(gè)指標(biāo)綜合考察Ala-Gln對(duì)人頰黏膜成纖維細(xì)胞生物活性的影響。

結(jié)果顯示，A8、A4、G8和G4組，12 h內(nèi)細(xì)胞數(shù)目和ALP水平均明顯高于對(duì)照組，但24 h后二者幾乎較12 h時(shí)無明顯變化，可能由于氨的生成較多，Gln的利用受到抑制，Gln在生成谷氨酸后經(jīng)過脫氫途徑的量減少，更多地向轉(zhuǎn)氨途徑，與脫氫途徑相比，細(xì)胞通過轉(zhuǎn)氨途徑產(chǎn)生的氨較少，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用也較小。這與高氨濃度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞需要調(diào)整能量代謝的速率與生物合成的速率相協(xié)調(diào)的觀點(diǎn)相符；而在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，氨對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，遵循二級(jí)抑制模型，其模型常數(shù)Ka為4.46(mmol/L)2[14]。本研究中，A2和G2組在48 h后，以及A1和G1組在60 h后出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化減緩，可能與Gln分解造成的氨濃度增高有關(guān)。A1/2、A1/4、G1/8和G1/4組72 h內(nèi)一直保持較好的生長(zhǎng)曲線，48 h內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)和ALP水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；48 h后，G1/2和G1/4組的細(xì)胞生長(zhǎng)和ALP水平相對(duì)于A1/2和A1/4組稍偏低，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測(cè)原因?yàn)镚ln在水溶液中不穩(wěn)定，可能與Gln有效成分降低和Gln分解造成氨水平增高有一定關(guān)聯(lián)，也應(yīng)予以綜合考慮。A1/8和G1/8組從一開始就生長(zhǎng)緩慢，ALP水平偏低，與其他濃度組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，60 h后均停止生長(zhǎng)并逐漸下降；而A1/2和G1/2組較A1/4和G1/4組的細(xì)胞生長(zhǎng)好，ALP水平也較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明Ala-Gln和Gln對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響存在濃度依耐性。

在細(xì)胞蛋白水平方面，無論是A組還是G組，在1/8～1/2濃度，其蛋白水平呈濃度依賴性。1/2濃度組蛋白水平也明顯高于1倍濃度組，而2～8倍濃度組水平明顯降低，可能是Gln代謝和分解產(chǎn)生了高濃度的氨，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A組的細(xì)胞蛋白水平及

ALP水平略高于G組，估計(jì)與Ala-Gln代謝過程中產(chǎn)生的丙氨酸作為另一種氨基酸來源參與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)。

綜上所述，Ala-Gln可以提高人頰黏膜成纖維細(xì)胞的ALP和細(xì)胞蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高細(xì)胞活性，當(dāng)Ala-Gln濃度過高或過低可影響細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，以1/2倍推薦濃度(即Ala-Gln濃度為16.5 mg/mL)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)情況最好。

[1]Babaee N,Baradaran M,Mohamadi H,et al.Therapeutic effects of Zataria Multiflora essential oil on recurrent oral aphthous lesion[J].Dent Res J (Isfahan),2015,12(5):456-460.

[2]Tarakji B,Gazal G,Al-Maweri SA,et al.Guideline for the diagnosis and treatment of recurrent aphthous stomatitis for dental practitioners[J].J Int Oral Health,2015,7(5):74-80.

[3]劉壽榮,黃文豹.谷氨酰胺對(duì)急性肝功能不全大鼠的防治作用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2015,22(6):508-510.

[4]Pradelli L,Povero M,Muscaritoli M,et al.Updated cost-effectiveness analysis of supplemental glutamine for parenteral nutrition of intensive-care patients[J].Eur J Clin Nutr,2015,69(5):546-551.

[5]Stehle P,Kuhn KS.Glutamine:An obligatory parenteral nutrition substrate in critical care therapy[J].Biomed Res Int，2015，2015:545467.

[6]Jakopin M.Murabutide revisited:a review of its pleiotropic biological effects[J].Curr Med Chem,2013,20(16):2068-2079.

[7]章靜波.組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2014:66.

[8]王春，向?qū)W熔,楊鑫,等.鹽酸小檗堿抑制人頰黏膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)的初步實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,39(10):1222-1223.

[9]張優(yōu)琴,江春霞,王智巍,等.復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的臨床治療進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2015,26(35):5030-5032.

[10]Kalaev VN,Artiukhov VG,Nechaeva MS.Micronucleus test of human oral buccal epithelium:problems,progress and prospects[J].Tsitol Genet，2014,48(6):62-80.

[11]薛雅蓉,莊重,劉智慧.設(shè)計(jì)利用現(xiàn)代科學(xué)儀器 緊跟科學(xué)前沿的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2013,30(6):163-166.

[12]Ivanov KP.Modern medical problems of energy exchange in humans[J].Vestn Ross Akad Med Nauk,2013，6(1):56-59.

[13]Bishop N.Clinical management of hypophosphatasia[J].Clin Cases Miner Bone Metab,2015,12(2):170-173.

[14]黃劍峰,王佳鳴,崔磊.氨對(duì)人表皮角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù),2007,2(2):123-129.

The influence of alanyl-glutamine on the bioactivity of human buccal fibroblasts in vitro*

Che Keke1,Liu Xin2△,Qing Shanglan2,Zhang Xicheng2

(1.Department of Pharmacy;2.Department of Stomatology,People′s Hospital of Chongqing,Chongqing 400014,China)

ObjectiveTo study the influence of alanyl-glutamine (Ala-Gln) on the cells growth,protein synthesis,and alkaline phosphatase (ALP) bioactivity of human buccal fibroblasts in vitro.MethodsThe human buccal fibroblasts in vitro were divided into the control group(group N ),Ala-Gln group (group A) and Gln group (group G).Group A and G set up 7 gradient concentrations(8,4,2,1,1/2,1/4,1/8 times recommended concentration) respectively,then cultured for 12,24,36,48,60 and 72 h.Flow cytometry was used to count cells,and drew cell growth curve as well.In addition,the ALP concentration in the corresponding period was detected by using euzymelinked immunosorbent assay,the total protein content of the cells was detected after 72 h.ResultsThe amount of cells in group N did not change obviously within 72 h,ALP contents increased over time but the changes in group A and G were more significant(P<0.05).The cell growths in group A,G were obviously accelerated within 24 h,and the content of ALP also increased significantly (P<0.05).The change of 1/2 times recommended concentration group was significantly better than that of other concentration groups.The cell protein contents of each drug concentration group were higher than group N(P<0.05).ConclusionAla-Gln can accelerate the growth of buccal fibroblasts.However,when the concentration is too high or too low,the sustaining growth of cells is depressed.The 1/2 times recommended concentration of Ala-Gln(16.5 mg/mL) is more reasonable.

mouth mucosa;fibroblasts;alkaline phosphatase;alanyl-glutamine;cell growth

重慶市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2013-02-098，2015MSXM067)。作者簡(jiǎn)介：車坷科(1981-)，主管藥師,在讀博士，主要從事臨床藥物治療學(xué)與生物藥劑學(xué)研究。△

，E-mail:ares_young@163.com。

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.002

R963

A

1671-8348(2016)22-3028-03

2016-02-08

2016-03-15)