鄭麗蓉,施賢清

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,貴陽(yáng) 550004;2.貴州省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，貴陽(yáng) 550002)

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兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分離方法研究*

鄭麗蓉1,施賢清2△

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,貴陽(yáng) 550004;2.貴州省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，貴陽(yáng) 550002)

目的建立一種快速、有效的分離兔蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(BASMCs)的方法。方法采用木瓜蛋白酶、二硫赤蘚糖醇(DTE)、膠原酶(Ⅺ型)兩步法急性分離兔SAH后BASMCs。利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定BASMCs成活率。結(jié)果分離出BASMCs的數(shù)量(40.33±10.18)個(gè)/200倍視野，鏡下觀察絕大多數(shù)平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，包膜完整光滑，細(xì)胞成活率為80%。結(jié)論該方法能快速、有效地分離BASMCs,并獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，為SAH后腦血管痙攣(CVS)BASMCs上離子通道的膜片鉗研究創(chuàng)建了條件。

兔；蛛網(wǎng)膜下腔出血；基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；分離方法

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)后腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)的發(fā)病率高達(dá)30%～90%，是導(dǎo)致患者高傷殘率和高病死率的主要原因之一[1]。隨著電生理技術(shù)的發(fā)展，膜片鉗逐漸運(yùn)用于CVS發(fā)生機(jī)制中離子通道的研究，而獲取單個(gè)理想的基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(basilar artery smooth muscle cells,BASMCs)對(duì)單細(xì)胞膜片鉗研究極為重要[2-5]。本實(shí)驗(yàn)觀察木瓜蛋白酶、二硫赤蘚糖醇(DTE)、膠原酶(Ⅺ型)兩步酶消化法能否快速有效地分離BASMCs，從而為單細(xì)胞膜片鉗研究創(chuàng)造條件。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄不拘，由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器倒置顯微鏡(OLYMPUS，型號(hào)IX70)；解剖顯微鏡(Olympus,型號(hào)SZX7)；恒溫水浴箱(ATAGO，型號(hào)60-C4)；電子天平(流陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司，型號(hào)ESJ120-4)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑和配置方法木瓜蛋白酶、DTE、膠原酶(Ⅺ型)均購(gòu)自SIGMA。生理鹽溶液(PSS液)成分：NaCl 140 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，MgCl21.3 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用NaOH調(diào)溶液pH為7.4。灌流液成分：NaCl 125 mmol/L，BaCl210 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，TEA-Cl 4 mmol/L，MgCl21 mmol/L，用NaOH 調(diào)溶液pH為7.3。酶溶液Ⅰ：1 mL PSS液中加入0.3 mg/mL木瓜蛋白酶和1 mg/mL DTE。酶溶液Ⅱ：1 mL PSS液中加入1 mg/mL膠原酶(Ⅺ型)。PSS、灌流液配置后4 ℃保存?zhèn)溆茫溉芤孩?、酶溶液Ⅱ配置?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1SAH模型制作通過(guò)枕大池注入非抗凝自體動(dòng)脈血復(fù)制SAH模型[6]，具體步驟如下：麻醉后馬上使兔俯臥頭低位固定在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用頭皮針經(jīng)枕骨下間隙輕輕刺入，有突破感后見(jiàn)清亮腦脊液流出，然后取耳中動(dòng)脈非抗凝血按1 mL/kg注入,局部按壓1 min，注射完后取30°頭低位30 min，然后側(cè)臥位觀察，待自然蘇醒抬頭后放入兔籠，完全蘇醒后送回動(dòng)物飼養(yǎng)室觀察,給予正常喂養(yǎng)。

1.2.2取材[7-8]正常喂養(yǎng)48 h后，3%戊巴比妥鈉麻醉后迅速斷頭取出腦組織，放在4 ℃、在充予95%O2/5%CO2混合氣體的PSS液中分離基底動(dòng)脈，并在解剖顯微鏡下剪去小的血管分支和清除其周圍組織，縱向切開(kāi)血管，清洗掉血紅蛋白，刮除血管內(nèi)皮，將血管剪成細(xì)塊狀。

1.2.3BASMCs的分離按下列步驟進(jìn)行酶消化：先將基底動(dòng)脈移入酶溶液Ⅰ中并放在37 ℃恒溫水浴箱中消化20 min，移去酶溶液Ⅰ，加入酶溶液Ⅱ并放在37 ℃恒溫水浴箱中繼續(xù)消化30 min，然后終止消化，用4 ℃的PSS液沖洗3次，最后用尖端鈍的吸管反復(fù)吹打直到有足夠數(shù)量的單個(gè)血管平滑肌細(xì)胞釋放出來(lái)。分離好的細(xì)胞懸液置4 ℃冰箱保存。

1.2.4細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞成活率檢測(cè)吸取適量BASMCs溶液在倒置顯微鏡下觀察平滑肌細(xì)胞形態(tài)。吸取0.4 mL BASMCs溶液,加入0.1 mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液,吹打混勻,室溫下染色3～5 min,吸取適量在顯微鏡下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率=(細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2　結(jié)　　果

2.1SAH模型注血后，兔出現(xiàn)煩躁，呼吸、心率加快，麻醉蘇醒后精神萎靡、嗜睡，飲水及進(jìn)食減少，體質(zhì)量減輕。斷頭開(kāi)顱取腦組織，見(jiàn)兔后顱窩各腦池內(nèi)殘留大小不等的暗紅色血凝塊，以基底池較重，周圍蛛網(wǎng)膜部分粘連，見(jiàn)圖1。

2.2細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)觀察及細(xì)胞成活率檢測(cè)分離出BASMCs數(shù)量(40.33±10.18)個(gè)/200倍視野，在倒置相差顯微鏡下絕大多數(shù)呈長(zhǎng)梭形或橢圓形，長(zhǎng)梭形的平滑肌細(xì)胞數(shù)量最多，胞膜完整、光滑、折光度高、胞質(zhì)均勻，見(jiàn)圖2。健康的正常細(xì)胞能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，而死亡的細(xì)胞膜的完整性喪失，通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。顯微鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)平滑肌細(xì)胞，80%以上的細(xì)胞胞質(zhì)未被染色，細(xì)胞存活率80%以上，見(jiàn)圖3。

圖1 枕大池內(nèi)血凝塊圖2 BASMCs光鏡照片(×200)圖3 BASMCs臺(tái)酚藍(lán)染色(×200)

3　討　　論

實(shí)體組織材料的細(xì)胞分離常用方法有機(jī)械分散法、酶消化分離法和細(xì)胞培養(yǎng)。機(jī)械分散法僅適用于處理纖維成分少的軟組織，此法雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。由于兔基底動(dòng)脈纖維成分相對(duì)較多，管徑細(xì)小，單純的機(jī)械分散法不足以高效的分離BASMCs。而細(xì)胞培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，受生長(zhǎng)過(guò)程中的多因素影響，較難滿足膜片鉗的需要[9-11]。本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶、DTE、膠原酶(Ⅺ型)兩步酶消化，膠原酶(Ⅸ型)適用于消化纖維多的組織，分離效果較好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PSS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率。通常，傳統(tǒng)的單一膠原酶消化法存在著明顯的不足，組織經(jīng)過(guò)膠原酶處理后會(huì)釋放出大量的膠原蛋白，膠原蛋白呈絮狀，使上清很難分離開(kāi)，妨礙細(xì)胞從組織中釋放出來(lái)，而木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，將肌纖維組織中連接的細(xì)胞外基質(zhì)解離，使細(xì)胞更容易游離出組織。

影響分離細(xì)胞成功率的關(guān)鍵因素包括消化酶的種類及濃度、消化的時(shí)間、環(huán)境的溫度、pH、血管的來(lái)源和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬及狀態(tài)等諸多因素。在消化過(guò)程中,酶消化時(shí)間太短時(shí),組織沒(méi)有被分解，細(xì)胞分離數(shù)目不多；而消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng),易損傷膜表面的蛋白質(zhì),使細(xì)胞產(chǎn)生破損，所有消化酶的用量和時(shí)間較難掌握，很難判斷消化的程度是否達(dá)到需要，需探索最適宜酶濃度及酶解時(shí)間，并保證酶的最佳活性溫度及最適pH值[4-5，8，12]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用膠原酶(Ⅸ型)和木瓜蛋白酶，并在酶解液中加入DTE，用以保護(hù)細(xì)胞，經(jīng)多次探索發(fā)現(xiàn)在含木瓜蛋白酶0.3 mg/mL 37 ℃水浴消化20 min、膠原酶(Ⅺ型)1 mg/mL 37 ℃水浴消化30 min，酶解液pH 7.3，能防止酶解過(guò)度或不全的情況發(fā)生。

操作過(guò)程注意事項(xiàng)[2,9,12-15]：由于基底動(dòng)脈平滑肌對(duì)各種機(jī)械和理化刺激十分敏感，故在分離血管的過(guò)程中動(dòng)作一定要輕柔，避免機(jī)械牽拉血管，可在解剖顯微鏡下取材。分離血管和細(xì)胞的液體最好新鮮配制，或配好后分裝，放置在-20 ℃冰箱內(nèi)保存,使用前再調(diào)一次pH值，以確保pH值在7.2～7.4。在分離血管的整個(gè)過(guò)程中將腦組織置于4 ℃的PSS溶液中，可降低整個(gè)腦組織的代謝，從而保護(hù)血管組織活性。另外，在分離過(guò)程中溶液始終要充氧，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)所采取的急性酶解法能成功得到單個(gè)的BASMC,數(shù)量滿意，自血管分離到消化成單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程大約只需60 min，而且消化后所得到的單個(gè)血管平滑肌細(xì)胞狀態(tài)良好,存活率高，為SAH后CVS的BASMCs上離子通道的電研究提供了理想的單個(gè)平滑肌細(xì)胞。

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Isolation of smooth muscle cells from rabbit basilar artery after subarachnoid hemorrhage*

Zheng Lirong1,Shi Xianqing2△

(1.Graduate School,Guiyang Medical University，Guiyang,Guizhou 550004,China;2.Department of Intensive Care Unit,GuiZhouProvincial People′s Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,China)

ObjectiveTo establish a fast and efficient method to isolate basilar artery smooth muscle cells (BASMCs) form rabbit after subarachnoid hemorrhage (SAH).MethodsSingle BASMCs were obtained by sequential two-step enzyme digestion with papain,DTE and collagenase type Ⅺ.The cell count and cellular morphology were observed by inverted microscope.The survival ratio was measured by trypan blue method.ResultsThe number of isolated smooth muscle cells was 40.33±10.18 per 200 times of field of vision.Under the microscope,most smooth muscle cells showed a long spindle shape,the film was smooth,and the survival rate was 80%.ConclusionThe method can separate BASMCs rapidly and effectively,and obtain a sufficient number of cells,it may be provide enough cells for the research of ion channels on BASMCs with cerebral vasospasm (CVS) after SAH.

rabbit；subarachnoid hemorrhage;basilar artery smooth muscle cells;isolation method

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2010]2155號(hào))。作者簡(jiǎn)介：鄭麗蓉(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事腦保護(hù)研究?！?/p>

，E-mail:364888849@qq.com。

·技術(shù)與方法·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.028

R743.35

A

1671-8348(2016)22-3107-02

2016-02-12

2016-03-15)