張林霞，李曉東

(河北省唐山市工人醫(yī)院：1.老年病三科；2.腎內(nèi)科　063000)

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乙醛對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞合成分泌TGF-β1的影響研究

張林霞1，李曉東2△

(河北省唐山市工人醫(yī)院：1.老年病三科；2.腎內(nèi)科063000)

目的通過(guò)研究乙醛對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞合成分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的影響，以探討乙醛導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的機(jī)制。方法選取人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中。以不同濃度的乙醛(0、50、100、200、400 μmol/L)刺激HK-2細(xì)胞24 h。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)HK-2細(xì)胞中TGF-β1的基因表達(dá)；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中TGF-β1的蛋白表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平。結(jié)果RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，乙醛呈劑量依賴(lài)性地增加HK-2細(xì)胞中TGF-β1基因和蛋白的表達(dá)；ELISA法結(jié)果顯示，乙醛呈劑量依賴(lài)性地增加HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平。結(jié)論乙醛能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞合成分泌TGF-β1，從而促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

乙醛；腎小管上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；腎小管間質(zhì)纖維化

眾所周知，長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)導(dǎo)致肝臟損害，嚴(yán)重時(shí)可造成酒精性肝硬化。機(jī)體攝入大量的乙醇后，約90%在肝臟乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙醛，并進(jìn)入血液循環(huán)。腎臟是僅次于肝臟的乙醇排泄器官。乙醇及其代謝產(chǎn)物通過(guò)腎臟排泄到尿中，尿中乙醇及代謝產(chǎn)物的水平高于肝臟及血液中的水平[1]。因此，長(zhǎng)期過(guò)量飲酒也可導(dǎo)致乙醇性腎損害[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，乙醇性腎損傷病理表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)的炎癥改變及纖維化[3]，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是目前公認(rèn)的促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵性的細(xì)胞因子[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞合成分泌TGF-β1的影響，為明確乙醇導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞株)由唐山市工人醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。乙醛購(gòu)自天津鼎盛鑫化工有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生工合成。兔抗人TGF-β1多克隆抗體、小鼠抗人Tubulin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司。堿性磷酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，BCIP/NBP顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天。TGF-β1ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R & D公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中。實(shí)驗(yàn)前換成無(wú)血清培養(yǎng)液同步化24 h。參照有關(guān)文獻(xiàn)[5]，分別加入含終濃度為0、50、100、200、400 μmol/L乙醛的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞或培養(yǎng)上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)TGF-β1基因表達(dá)應(yīng)用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化收集細(xì)胞，應(yīng)用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定A260/A280=1.8～2.0，計(jì)算其水平。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計(jì)參考有關(guān)文獻(xiàn)[6]。TGF-β1(306 bp)：上游引物5′- AGG TCA CCC GCG TGC TAA T -3′，下游引物5′- TCA ACC ACT GCC GCA CAA CT -3′ 。β-actin (202 bp)：上游引物5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′，下游引物5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′ 。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共28個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，應(yīng)用Bio-Rad聯(lián)機(jī)專(zhuān)用軟件分析電泳條帶灰度值。

1.2.3蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)應(yīng)用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化收集細(xì)胞，加入含PMSF的細(xì)胞裂解液，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 g/min離心5 min提取總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白水平。取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人TGF-β1多克隆抗體(1∶800)和小鼠抗人Tubulin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜。洗膜后分別加入堿性磷酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶1 000)、山羊抗小鼠二抗(1∶1 000)，BCIP/NBT顯色。應(yīng)用Image J圖像分析軟件分析TGF-β1及Tubulin條帶的灰度值。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平。

2　結(jié)　　果

2.1乙醛對(duì)細(xì)胞中TGF-β1基因表達(dá)的影響正常HK-2細(xì)胞中有少量的TGF-β1的基因表達(dá)，50 μmol/L乙醛刺激HK-2細(xì)胞24 h后TGF-β1的基因表達(dá)較對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，TGF-β1的基因表達(dá)量明顯增加，并具有一定的濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1　乙醛對(duì)TGF-β1基因表達(dá)的影響

2.2乙醛對(duì)細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)的影響正常HK-2細(xì)胞中有少量的TGF-β1的蛋白表達(dá)，50 μmol/L乙醛刺激HK-2細(xì)胞24 h后TGF-β1的蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著增加(P>0.05)，但100 μmol/L乙醛刺激HK-2細(xì)胞24 h后TGF-β1的蛋白表達(dá)較對(duì)照組比較明顯增加(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，TGF-β1的蛋白表達(dá)量明顯增加，具有一定的濃度依賴(lài)性。見(jiàn)圖2。

2.3乙醛對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平的影響正常HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平很低(216.42±60.75)μg/L，100 μmol/L乙醛刺激HK-2細(xì)胞24 h后培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平開(kāi)始增加(325.72±74.52)μg/L，較對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著乙醛濃度的升高，培養(yǎng)上清液中TGF-β1的水平明顯增加，分別為(515.72±49.08)μg/L、(585.08±78.03)μg/L，具有一定的濃度依賴(lài)性。

圖2　乙醛對(duì)TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

3　討　　論

長(zhǎng)期大量飲酒可導(dǎo)致全身多臟器損害。機(jī)體攝入乙醇后約90%在肝臟代謝，攝入的乙醇在肝臟乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙醛并進(jìn)入血液循環(huán)。肝臟是乙醇代謝的主要器官，也是最容易損傷的器官。乙醛能夠刺激肝星狀細(xì)胞活化、增殖，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原及TGF-β1的表達(dá)明顯增加，是形成乙醇性肝硬化的中心環(huán)節(jié)[7-8]。由于腎臟的血供豐富，過(guò)量飲酒后，超過(guò)肝臟的代謝能力，容易導(dǎo)致過(guò)量的乙醇、乙醛在腎臟蓄積，從而引起腎臟損害。乙醇灌胃導(dǎo)致的大鼠腎損傷模型，病理表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，α-SMA表達(dá)陽(yáng)性[9]，促纖維化的細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)明顯增強(qiáng)[10]，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。

TGF-β1是目前公認(rèn)的導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。本課題建立了乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷的體外模型。進(jìn)一步研究證實(shí)，乙醛能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞合成分泌TGF-β1。TGF-β1可能通過(guò)自分泌或旁分泌的方式，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞、促進(jìn)致炎性細(xì)胞因子的釋放等環(huán)節(jié)[11-13]，促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。采取措施阻斷乙醛對(duì)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)TGF-β1的合成及分泌，對(duì)減輕乙醛對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞功能，延緩腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展具有一定的臨床意義。

[1]Tominaga Y.Use of acetaldehyde and methanol as markers of alcohol abuse and their measurement[J].Nihon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi,2009,44(1):26-37.

[2]Harris PS,Roy SR,Coughlan C,et al.Chronic ethanol consumption induces mitochondrial protein acetylation and oxidative stress in the kidney[J].Redox Biol,2015,6(12):33-40.

[3]胡曉琴,邱皓,呂曉云,等.康腎合劑對(duì)酒精性腎損害大鼠腎組織NF-κB活化及IL-6水平的影響[J].西部中醫(yī)藥,2015,28(3):11-13.

[4]Kim D,Lee AS,Jung YJ,et al.Tamoxifen ameliorates renal tubulointerstitial fibrosis by modulation of estrogen receptor α-mediated transforming growth factor-β1/Smad signaling pathway [J].Nephrol Dial Transplant,2014,29(11):2043-2053.

[5]Wang H,Guan W,Yang W,et al.Caffeine inhibits the activation of hepatic stellate cells induced by acetaldehyde via adenosine A2A receptor mediated

by the cAMP/PKA/SRC/ERK1/2/P38 MAPK signal pathway [J].PLoS One,2014,9(3):e92482.

[6]李曉東,李英,丁新國(guó),等.1,25(OH)2D3對(duì)甲狀旁腺素誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和TGF-β1的表達(dá)的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(2):156-159.

[7]Szuster-Ciesielska A,Mizerska-Dudka M,Daniluk J,et al.Butein inhibits ethanol-induced activation of liver stellate cells through TGF-β,NFκB,p38,and JNK signaling pathways and inhibition of oxidative stress[J].J Gastroenterol,2013,48(2):222-237.

[8]Reyes-Gordillo K,Shah R,Arellanes-Robledo J,et al.Mechanisms of action of acetaldehyde in the up-regulation of the human α2(I) collagen gene in hepatic stellate cells:key roles of Ski,SMAD3,SMAD4,and SMAD7[J].Am J Pathol,2014,184(5):1458-1467.

[9]張健,王炳元.酒精性腎損害時(shí)α-SMA的表達(dá)及復(fù)方中藥的干預(yù)作用[J].中國(guó)實(shí)用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志,2012,17(12):69-70.

[10]邱皓,滕玉蓮,劉文,等.中藥康腎合劑對(duì)酒精性腎損傷大鼠尿酶變化及腎臟TGF-β1mRNA表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(12):3714-3716.

[11]Zheng RP,Bai T,Zhou XG,et al.Lefty A protein inhibits TGF-β1-mediated apoptosis in human renal tubular epithelial cells[J].Mol Med Rep,2013,8(2):621-625.

[12]Yang L,Ma X,Cheng T,et al.Effect of tangnaikang on TGF-beta1-induced transdifferentiation of human renal tubular epithelial HK-2 cells[J].J Tradit Chin Med,2013,33(3):388-393.

[13]Sark?zi R,Flucher K,Haller VM,et al.Oncostatin M inhibits TGF-β1-induced CTGF expression via STAT3 in human proximal tubular cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,424(4):801-806.

Effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of TGF-β1in human renal tubular epithelial cells

Zhang Linxia1,Li Xiaodong2△

(1.Third Department of Geriatrics;2.Department of Nephrology,Tangshan City Workders′ Hospital, Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of acetaldehyde on synthesis and secretion of transforming growth factor-β1(TGF-β1) in human renal tubular epithelial cells,and to explore the mechanism of alcohol induced renal tubulointerstitial fibrosis.MethodsIn vitro,the human renal tubular epithelial cells (HK-2 cell line) were cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 5% fetal bovine serum.The cells were exposed to acetaldehyde at various concentrations (0,50,100,200 and 400 μmol/L) for 24 h.The expression of TGF-β1gene in HK-2 cells was detected by RT-PCR;and the expression of TGF-β1protein was detected by Western blot;The content of TGF-β1in the supernatant of the cells was measured by ELISA assay.ResultsRT-PCR and Western blot results showed that acetaldehyde increased the expressions of TGF-β1gene and protein in HK-2 cells in a dose-dependent manner.The results of ELISA method showed that acetaldehyde increased the content of TGF-β1in the supernatant of HK-2 cells in a dose-dependent manner.ConclusionAcetaldehyde can promote the synthesis and secretion of TGF-β1in cultured human renal tubular epithelial cells in vitro,thus promoting the progress of renal tubulointerstitial fibrosis.

acetaldehyde;renal tubular epithelial cells;transforming growth factor-β1;renal tubulointerstitial fibrosis

張林霞(1971-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腎臟方面的研究?！?/p>

，E-mail:2460789769@qq.com。

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.005

R392.11

A

1671-8348(2016)22-3038-02

2016-02-25

2016-04-11)