孫工兵（黑龍江金九藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 密山 158306）

·論著·

日內(nèi)瓦毛霉對(duì)妊娠烯醇酮的生物轉(zhuǎn)化研究

孫工兵
（黑龍江金九藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 密山 158306）

目的探索日內(nèi)瓦毛霉微生物對(duì)妊娠烯醇酮的生物轉(zhuǎn)化問(wèn)題。方法將妊娠烯醇酮經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后，發(fā)生7-羥基化，得到兩種產(chǎn)物，通過(guò)紅外、核磁、質(zhì)譜分析，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果碳源、氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響很大，試驗(yàn)最佳的碳源、氮源確定為葡萄糖和蛋白胨，輔助氮源為酵母膏。結(jié)論通過(guò)單因素條件優(yōu)化，確定碳源和氮源加量分別為3.6%和1.3%。對(duì)不同濃度無(wú)機(jī)鹽KH2PO4對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，確定其濃度為0.16%，初始pH為4.5時(shí)，最終得到主產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為59.2%。

甾體；妊娠烯醇酮；日內(nèi)瓦毛霉；羥基化

在臨床應(yīng)用上，甾體激素是一類重要的激素藥物，廣泛的應(yīng)用歸因其生理活性［1］，這種作用活性于C11上的羥基化作用關(guān)系密切。

20世紀(jì)50年代美國(guó)普強(qiáng)藥廠利用微生物黑根霉的羥化酶將黃體酮一步轉(zhuǎn)化成11α-羥基黃體酮［2］，即對(duì)甾體化合物結(jié)構(gòu)的改造，這一方法成功地解決了皮質(zhì)激素合成中的最大難題，使微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)成為甾體藥物不可缺少的關(guān)鍵技術(shù)。先令公司開(kāi)發(fā)成功的口服避孕藥Yasmin（屈螺酮加炔雌醇），在美國(guó)和歐洲早已上市，7a，15α-二羥基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中間體，直接轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)單，副產(chǎn)物少［3］。研究表明，去氫表雄酮（DHEA）的7-羥基衍生物對(duì)治療癌癥和阿爾茨海默病有重要療效，同時(shí)它還具有抗糖皮質(zhì)激素作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和促進(jìn)減肥功效［4］。

本研究選擇日內(nèi)瓦毛霉對(duì)妊娠烯醇酮生物轉(zhuǎn)化的研究，對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化的同時(shí)，獲得了具有超強(qiáng)生物活性潛力的7-羥基甾體衍生物。7-羥基甾體衍生物的產(chǎn)率得到了進(jìn)一步的提高，為新藥的開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1　材料

1.1菌種：日內(nèi)瓦毛霉（M.genevensis），自篩，經(jīng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，農(nóng)業(yè)微生物中心（ACCC）鑒定為日內(nèi)瓦毛霉。

1.2培養(yǎng)基：分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，少量甾體；酵母膏培養(yǎng)液：蛋白胨12 g/L，葡萄糖40 g/L，磷酸二氫鉀1.3 g/L，酵母膏1 g/L，用1 mol/L HCl調(diào)pH為4.5；斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH為4.5。

2　方法

2.1薄層層析（TLC）：稱取27 g硅膠G置具塞三角瓶中，加3 g石蠟和50 mL三氯甲烷，制備成0.25 mm厚的硅膠薄層層析板（75 mm×25 mm）；濃硫酸∶甲醇=1∶1為顯色劑；丙酮∶石油醚=1∶3（V/V）作展開(kāi)劑。樣品用上行法展開(kāi)，將層析板浸于顯色液中取出，用電吹風(fēng)機(jī)吹干，吹干后用顯色劑噴霧，放在電熱板上加熱顯色。

2.2菌種分離篩選：標(biāo)本采集：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，取1 g土壤置于已滅菌的試管中，加10 mL無(wú)菌水，漩渦振蕩器振蕩搖勻，靜置，取上清液，滴于培養(yǎng)基中，再用玻璃棒涂勻。置27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d后，從分離培養(yǎng)基中挑出單菌落，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)1～5 d后，將純化的菌株移置到斜面培養(yǎng)基上，編號(hào)保存。將甾體底物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用薄層層析技術(shù)檢測(cè)，選出具有轉(zhuǎn)化甾體能力的優(yōu)良菌株。將初篩后得到的菌株再次進(jìn)行甾體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，復(fù)篩出轉(zhuǎn)化甾體效果更好的菌株。

2.3甾體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：取1支斜面菌種，用接種針將菌種加入已滅菌的裝有發(fā)酵液100mL的錐形瓶中。27℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，將1.5 g妊娠烯醇酮溶于30 mL丙酮中，在每瓶已生長(zhǎng)的菌液中加入2 mL丙酮溶液，相同條件下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4 d。

2.4甾體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離與分析：用乙酸乙酯將發(fā)酵液和菌絲體，減壓蒸餾萃取6次后，合并有機(jī)相，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑，真空干燥，柱層析分離，得到產(chǎn)物粗品后，以MS、IR和2D-NMR波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)。

3　結(jié)果

3.1菌種的分離與篩選：細(xì)菌、放線菌和真菌均具有甾體羥基化作用的微生物，我們用從土壤中篩選出的菌種進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，篩選時(shí)選用妊娠烯醇酮作為底物，最終獲得了轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)、效果較好的菌株日內(nèi)瓦毛霉。

3.2甾體生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離：在用硅膠柱層析技術(shù)分離產(chǎn)物時(shí)，曾經(jīng)選用了丙酮-石油醚、丙酮-二氯甲烷、丙酮-氯仿、氯仿-乙酸乙酯、氯仿-甲醇等體系進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在妊娠烯醇酮（1）的生物轉(zhuǎn)化中，以丙酮∶石油醚（1∶3）作展開(kāi)劑，可以成功地將混合物分開(kāi)，效果良好。

3.3日內(nèi)瓦毛霉對(duì)妊娠烯醇酮的轉(zhuǎn)化：妊娠烯醇酮在用Mucor genevensis進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)，生成7α，11α-二羥基妊娠烯醇酮2和7α，11β-二羥基妊娠烯醇酮3。通過(guò)紅外、質(zhì)譜分析、核磁等方法，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別是7α和11α-二羥基妊娠烯醇酮2，7α和11β-二羥基妊娠烯醇酮3，詳見(jiàn)表1。

表1　硅膠柱層析技術(shù)分離產(chǎn)物的理化常數(shù)結(jié)

3.4日內(nèi)瓦毛霉培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

3.4.1不同葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖濃度為3.5%時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，詳見(jiàn)表2。

表2　葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響（%）

3.4.2不同氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：試驗(yàn)結(jié)果表明，用酵母膏為氮源，轉(zhuǎn)化率為最高。但由于酵母膏和蛋白胨各有優(yōu)缺點(diǎn)：酵母膏成分復(fù)雜、價(jià)格較貴、稱重時(shí)難控制，蛋白胨價(jià)格相對(duì)便宜、稱重時(shí)易控制，因此該試驗(yàn)以蛋白胨為主要氮源，酵母膏為輔助氮源，詳見(jiàn)表3。

表3　不同氮源對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響（%）

3.4.3蛋白胨濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛?.4%時(shí)，轉(zhuǎn)化率最大，詳見(jiàn)表4。

表4　蛋白胨濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響（%）

3.4.4KH2PO4濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：研究結(jié)果表明，當(dāng)KH2PO4濃度為0.16%時(shí)，轉(zhuǎn)化率最大，詳見(jiàn)表5。

表5　KH2PO4濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響（%）

3.4.5培養(yǎng)基初始pH對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：培養(yǎng)基的初始pH影響產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。因此，羥基化酶反應(yīng)體系的pH以4.5效果最好，詳見(jiàn)表6。

表6　初始pH對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響（%）

4　討論

從土樣中篩選到1株能轉(zhuǎn)化甾體的菌株，經(jīng)鑒定為日內(nèi)瓦毛霉菌株。本文研究日內(nèi)瓦毛霉對(duì)妊娠烯醇酮的生物轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行了研究。通過(guò)利用紅外和二維核磁波譜技術(shù)，確定日內(nèi)瓦毛霉化學(xué)結(jié)構(gòu)為7α，11α-二羥基妊娠烯醇酮和7α，11β-二羥基妊娠烯醇酮。日內(nèi)瓦毛霉對(duì)妊娠烯醇酮的羥基化反應(yīng)發(fā)生在C-7位上，并具有位置專一性。

同時(shí)對(duì)培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化研究。研究了不同碳源、氮源對(duì)妊娠烯醇酮的轉(zhuǎn)化率的影響，確定葡萄糖和蛋白胨為試驗(yàn)最佳碳源和氮源，酵母膏為輔助氮源，單因素試驗(yàn)確定其含量分別為3.5%和1.4%；研究了無(wú)機(jī)鹽KH2PO4不同濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，確定其濃度分別為0.16%，初始pH為4.5時(shí)，最終得到主產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率是：59.2%。日內(nèi)瓦毛霉能夠?qū)Ｒ恍缘貙?duì)妊娠烯醇酮經(jīng)行羥基化反應(yīng)，這為研究妊娠烯醇酮藥物開(kāi)發(fā)及體內(nèi)代謝研究提供一定的理論依據(jù)。

［1］楊燦宇，杜連祥.甾體C11α-羥化菌株AF9612發(fā)酵條件的研究［J］.天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，23（2）：45-48.

［2］Wang J，Chen CZ，Li BA，et al.Enzyme Microb Technol ［J］.1998，22（3）：368-373.

［3］尚珂，胡海峰，朱寶泉.微生物轉(zhuǎn)化法合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用，2004，33 （2）：30-34.

［4］Phelan A，Elliott C，O'Hare P.Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22［J］.Nat Biotechnol，1998，16（4）：440-443.

Bio-Transformation of Pregnenolone by Mucor Genevensis

Sun Gongbing
（Heilongjiang Jinjiu Pharmaceutical Company Limited，Mishan 158300，China）

Microbial transformation of pregnenolone was studied in the Mucor genevensis culture，in which 7α，11α-dihydroxypregnenolone and 7α，11 β-dihy droxypregnenolone were given from the metabolites.The biotransformation products were determined by IR，NMR and MS analysis.The results showed that the optimal condition for the biosynthesis of 7α，11α—dihydr-roxypregnenolone was as follows：3.5%dextrose，1.4%peptone，0.16%potassium dihydydrogen phosphate，initial pH 4.5.The yield of 7α，11α-dihydroxypregnenolone was 59.2%.

Steroids；Biotransformation；Pregnenolone；Hydroxylation

R917

A學(xué)科分類代碼：31047

1001-8131（2016）04-0401-03

黑龍江省農(nóng)墾總局基金資助（HNK12KF-24）；大慶科技局科研項(xiàng)目（szd201126）

2016-03-01