王萍 馬予潔 王慶華 路君 譚建明

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·論著·

使用規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列cas9系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在小鼠黑色素瘤細(xì)胞中的作用

王萍 馬予潔 王慶華 路君 譚建明

目的 研究在小鼠黑色素瘤細(xì)胞系（B16）中使用成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）靶向敲除轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）后，細(xì)胞體外增殖、侵襲、遷移能力的變化。方法 使用CRISPR-cas9系統(tǒng)建立敲除TGF-β1的小鼠黑色素瘤細(xì)胞系，用細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測(cè)對(duì)照組、載體對(duì)照組與TGF-β1-組B16細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，用平板克隆與軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)三組細(xì)胞體外增殖能力，分別用Transwell小室與加基質(zhì)膠Transwell小室檢測(cè)三組細(xì)胞的體外遷移與侵襲能力。結(jié)果 成功建立TGF-β1敲除了的B16細(xì)胞系，生長(zhǎng)曲線在24、48、72、96h測(cè)得3組細(xì)胞數(shù)目之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；平板克隆一周結(jié)果顯示:TGF-β1-組的克隆形成率0.067±0.032小于載體對(duì)照組0.489±0.034，而載體對(duì)照組小于對(duì)照組0.633±0.041，F(xiàn)=198.710，P=0.000；平板克隆2周時(shí)，TGF-β-組的細(xì)胞克隆形成率0.443±0.012與對(duì)照組0.489±0.064均大于載體對(duì)照組0.370±0.005，F(xiàn)=7.599，P=0.023；還發(fā)現(xiàn)雖然TGF-β-組的克隆形成數(shù)量多，但是克隆的直徑小于其他兩對(duì)照組；軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn):對(duì)照組的形成率0.008±0.0001低于載體對(duì)照組0.012±0.0006與TGF-β1-組0.012±0.0007，F(xiàn)=65.39，P＜0.0001。侵襲能力實(shí)驗(yàn)顯示:TGF-β1-組穿過(guò)膜的B16細(xì)胞數(shù)目（12±4.359）個(gè)明顯的低于對(duì)照組（101±18.735）個(gè)與載體對(duì)照組細(xì)胞（100±8.889）個(gè)，F(xiàn)=52.34，P=0.0002；遷移能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TGF-β1-組的B16通過(guò)Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量（2.037±0.132）個(gè)明顯的少于對(duì)照組（4.07±0.481）個(gè)與載體對(duì)照組（8.683±1.017）個(gè)，F(xiàn)=81.34，P＜0.0001。結(jié)論 TGF-β1敲除后的小鼠黑色素瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)、增殖能力并沒(méi)有受到影響，但是侵襲與遷移能力受到了抑制。

小鼠； 黑色素瘤； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β； 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

黑色素瘤于19世紀(jì)初由Garswell命名，1894 年P(guān)aget提出其來(lái)源于黑痣。黑色素瘤惡性程度極高，占皮膚腫瘤死亡病例的極大部分。多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，也見(jiàn)于軟腦膜和脈絡(luò)膜［1］。然而現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，黑色素的合成異?？赡苁呛谏亓霭l(fā)生的關(guān)鍵因素［2］。但是到目前為止真正調(diào)節(jié)黑色素合成的途徑仍然不夠明確［3-4］，所以闡明黑色素合成的重要因子對(duì)于黑色素瘤的防治極其重要。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族的成員是多能生長(zhǎng)與分化因子，調(diào)節(jié)大規(guī)模的病理生理學(xué)過(guò)程，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞的遷移［5］，而現(xiàn)有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β家族及其成員會(huì)調(diào)節(jié)黑色素的合成［6］。黑色素瘤能夠成為最嚴(yán)重的皮膚癌癥的原因就是其很強(qiáng)的全身轉(zhuǎn)移能力［7］，TGF-β介導(dǎo)的增殖抵抗是黑色素瘤轉(zhuǎn)移的重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)［8］。所以研究TGF-β對(duì)黑色素瘤增殖能力的影響對(duì)黑色素瘤的防治有重要意義。本文主要研究在TGF-β家族中占有主導(dǎo)地位的TGF-β1在黑色素瘤中的作用。

基因組工程是使用設(shè)計(jì)的核酸酶來(lái)精確的編輯基因組序列，這一過(guò)程可以總結(jié)為兩個(gè)步驟:第一步，導(dǎo)入核酸酶或限制性的內(nèi)切酶到特定的DNA靶點(diǎn)，使DNA的雙鏈斷裂或者損壞；第二步，DNA的修復(fù)激活，通過(guò)內(nèi)源性的DNA在特定的靶點(diǎn)進(jìn)行損傷修復(fù)。在這一過(guò)程中有兩個(gè)修復(fù)途徑參與:（1）非同源性的末端鏈接；（2）同源修復(fù)。在過(guò)去的十年間，基因組編輯工具基于精準(zhǔn)的序列核酸酶和DNA鏈接蛋白，例如:鋅指核酸酶（ZFNs）［9-12］，大范圍核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活劑樣的效應(yīng)物TALEs［13-15］。這些技術(shù)都開啟了精確編輯的新紀(jì)元。而現(xiàn)在之所以以規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR）為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)被引用到這個(gè)領(lǐng)域，是由于其在真核細(xì)胞中易于設(shè)計(jì)、快速、花費(fèi)低和可檢測(cè)性?，F(xiàn)在已知CRISPR的三個(gè)系統(tǒng)［16-19］。在這些系統(tǒng)中，系統(tǒng)Ⅱ只需要一個(gè)單獨(dú)的蛋白就可以斷裂目的片段，叫做cas9。現(xiàn)已有多個(gè)研究機(jī)構(gòu)闡明了cas的分子結(jié)構(gòu)和作用，這些研究已經(jīng)證明cas9是一個(gè)RNA導(dǎo)向性的核酸，可以捆綁目的DNA導(dǎo)入一個(gè)雙鏈斷裂目的序列。使用這一系統(tǒng)可以導(dǎo)入不同的損傷，比如突變、插入、刪失甚至大量的染色體變遷，同時(shí)在相應(yīng)的位置產(chǎn)生非同源末端鏈接與同源修復(fù)［20-22］。

本文使用CRISPR-cas9系統(tǒng)體外敲除TGF-β1，來(lái)研究在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因TGF-β1的作用。

材料與方法

一、材料

1.主要設(shè)備和器材:超凈操作臺(tái)（中國(guó)蘇州凈化SW-OJ-3F）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置式生物顯微鏡（日本OLYPUS CKX41）；高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；可調(diào)微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Invitrogen公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica TCS-SP2）；電子分析天平（中國(guó)Sartorius BSA124S）；一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning公司）；恒溫水浴鍋（DKB-2215型，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司，F(xiàn)iltorMax F5）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國(guó)香港Gene Company Limited Gbox XR-5）；雙模塊梯度PCR儀（Bio-Rad Laboratories，C1000）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，7500）；Transwell小室（美國(guó)Corning公司）；24孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。

2.主要試劑與試劑配制:lentiCRISPRv2質(zhì)粒（美國(guó)addgene公司）；SgRNA的設(shè)計(jì)參照網(wǎng)站http://www.genome-engineering.org；其他所有包裝CRISPR-cas9的試劑購(gòu)買均參照http://www. genome-engineering.org/gecko/張峰實(shí)驗(yàn)室所出。

1640完全培養(yǎng)基配制:1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）中加入10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）和1%青霉素與鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國(guó)Gibco公司）；青霉素、鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）；DMED/F12完全培養(yǎng)基配制:DMED/F12完全培養(yǎng)基包含10%FBS、1%的青霉素鏈霉素；甲基紫染液:50ml甲醇，0.5g甲基紫，200ml雙蒸水；TGF-β1一抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；二抗（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；結(jié)晶紫（C3886，美國(guó)Sigma公司）；甲醇（美國(guó)羅氏公司）。

二、方法

（一）CRISPR-cas9系統(tǒng)體外基因敲除技術(shù)

CRISPR是指規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列，它是細(xì)菌利用來(lái)防御入侵病毒的一種系統(tǒng)的關(guān)鍵組件。cas9可以通過(guò)一種高序列特異性的方式結(jié)合DNA并切割它，從而得到能夠精確操控的DNA區(qū)域。cas9一類的酶為研究人員提供了比以往更快速、更廉價(jià)和更精確的基因編輯工具。本實(shí)驗(yàn)使用的體外敲除技術(shù)的原理與其它編輯技術(shù)相似，其難點(diǎn)在于guide RNA的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的位置決定了脫靶效率與實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。其整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)文獻(xiàn)［23］。

（二）B16細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16，1640培養(yǎng)基加入10%的胎牛血清，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究按細(xì)胞系處理的不同將細(xì)胞分為三組，B16陽(yáng)性對(duì)照組（Control）、TGF-β1敲除組（TGF-β1-組）與載體對(duì)照組（Vecter）。

（三）細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

分別將三種B16細(xì)胞種于24孔板中，10000細(xì)胞/孔，于24、48、72、96h后，用100μl胰酶徹底消化細(xì)胞，取10μl細(xì)胞懸液加10μl臺(tái)盼藍(lán)在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)細(xì)胞。每次消化3個(gè)孔，24個(gè)孔剛好滿足4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。注意:首次種植細(xì)胞的數(shù)目，根據(jù)細(xì)胞種類的不同而有差異，但是必須滿足到96h時(shí)細(xì)胞的密度沒(méi)有達(dá)到抑制生長(zhǎng)的狀況，所以在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)該先確定細(xì)胞的種植數(shù)量。

（四）平板克隆實(shí)驗(yàn)

（1）分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、載體對(duì)照組、TGF-β1-組B16細(xì)胞，用胰酶消化后，在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)，每組細(xì)胞分別取500個(gè)種入60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每組做3個(gè)平行樣；（2）置于37℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間不換液，每3～5d加入新鮮培養(yǎng)基。分別于7d、14d后，倒掉培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，用甲基紫甲醇固定液固定并染色3min，隨后用PBS洗干凈多余的甲基紫；（3）放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Gene Company Limited Gbox XR-5，中國(guó)香港）中用計(jì)數(shù)克隆的功能計(jì)數(shù)克隆的數(shù)目與克隆直徑并且拍照。在儀器中設(shè)定只計(jì)數(shù)直徑大于2mm的克隆。計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=克隆形成數(shù)/500；（4）最后以三組細(xì)胞為橫坐標(biāo)，克隆形成率為縱坐標(biāo)繪制柱狀圖，觀察三組細(xì)胞的克隆形成率。并且以克隆直徑為縱坐標(biāo)，以三組B16細(xì)胞為橫坐標(biāo)做柱狀圖，觀察三組細(xì)胞克隆形成大小的差異。

（五）錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

1.準(zhǔn)備下層膠:用雙蒸水與瓊脂糖配制出1.4%低熔點(diǎn)瓊脂糖液（Agar），高壓滅菌后，置于40℃水浴鍋中平衡溫度45min。同時(shí)將2×的培養(yǎng)基（2×1640+20%FBS）放在40℃水浴鍋中均衡溫度45min。將等體積的上述兩種液體混勻，以制備0.7%Agar+（1×1640+10%FBS）。將1.5ml的混合液注入35mm皿中，避免氣泡產(chǎn)生，等待1h以使膠完全凝固。

2.制備上層膠:用雙蒸水配制出0.7%Agar，高壓滅菌后，置于40℃水浴鍋中平衡溫度45min。將（2×1640+20%FBS）在40℃水浴鍋中均衡溫度45min。

消化各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)，此實(shí)驗(yàn)需要細(xì)胞10000個(gè)/皿。用培養(yǎng)基調(diào)整體積使細(xì)胞數(shù)為40000個(gè)/ml。

將1ml細(xì)胞懸液加入15ml離心管中，然后加入3ml（2×1640培養(yǎng)基+20%FBS）與3ml的0.7%Agar。輕柔吹打混勻。在皿的底層膠上面緩緩注入1.5ml上述混勻液，避免氣泡產(chǎn)生，每組設(shè)定3個(gè)平行樣。待上層膠凝固后，在上層輕輕滴入500μl培養(yǎng)基。

將皿置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間每隔3d，補(bǔ)加500μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)14d后，細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。每組設(shè)定3個(gè)平行樣，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。軟瓊脂克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)。

（六）Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用微濾膜培養(yǎng)小室來(lái)檢驗(yàn)三組細(xì)胞的遷移能力，濾膜上面有8μm的微孔可允許細(xì)胞穿過(guò)到達(dá)膜下面，這些穿過(guò)去的細(xì)胞可黏附于膜下面，通過(guò)黏附細(xì)胞的數(shù)量來(lái)反映遷移情況。具體的實(shí)驗(yàn)步驟:于實(shí)驗(yàn)前1d分別對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，第2天消化饑餓處理過(guò)的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，分別取1000個(gè)細(xì)胞溶于700μl無(wú)血清的1640培養(yǎng)基中。種入小室內(nèi)，小室放入24孔板孔中，24孔板中加入1 ml含有10%FBS的1640培養(yǎng)基。注意小室底部與24孔板培養(yǎng)基之間不能有氣泡。隨后放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。然后取出小室，用PBS洗后，用4%的甲醇固定3min，后用PBS洗3次，甲基紫染色3min后，再用PBS洗后，在顯微鏡下拍照。隨后在24孔板中加入100%的乙醇，將小室放入其中，在搖床上搖10min，隨后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處各孔的吸光度值（A）。遷移實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

（七）Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

與Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)基本相同，唯一不同的是使用的是鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、建立敲除TGF-β1的小鼠黑色素瘤（B16）細(xì)胞系

人類的TGF-β有3個(gè)基因型，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。由于TGF-β1在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著主要作用，所以本研究在黑色素瘤細(xì)胞中（B16）使用CRISPR-cas9系統(tǒng)敲除TGF-β1，研究TGF-β1在黑色素瘤細(xì)胞系中的作用。首先筆者設(shè)計(jì)的2條gRNA均位于TGF-β1的第一個(gè)外顯子上面，是由于其它的外顯子有嚴(yán)重的脫靶性危險(xiǎn)，只有位于第一個(gè)外顯子上面的sgRNA有低的脫靶效率（圖1a，b）。兩個(gè)sgRNA使用的是同一個(gè)TGF-β引物，PCR引物的上游位于第1個(gè)外顯子的前端，下游引物位于第1個(gè)外顯子的后端，這條引物可以擴(kuò)增出切割片段是否發(fā)生錯(cuò)誤的修復(fù)。最后本研究成功建立了TGF-β1-#1、TGF-β1-#2、TGF-β1-#3細(xì)胞系（圖1c）。測(cè)序發(fā)現(xiàn)TGF-β1-#1、TGF-β1-#2、TGF-β1-#3細(xì)胞系的TGF-β1的DNA雙鏈均發(fā)生了錯(cuò)誤的修復(fù)。因此可認(rèn)定小鼠黑色素瘤細(xì)胞系（B16）已經(jīng)失去表達(dá)TGF-β1（圖1c）。

二、TGF-β1敲除后B16細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

為了檢測(cè)三組細(xì)胞生長(zhǎng)能力的差異性，本實(shí)驗(yàn)在每組接種1000個(gè)細(xì)胞后，于24、48、72、96h分別細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖2），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三組細(xì)胞數(shù)目使用方差分析統(tǒng)計(jì)處理后發(fā)現(xiàn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)P均＞0.05。研究結(jié)果表明:TGF-β1敲除后的B16細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況并沒(méi)有受到影響。

圖1 使用CRISPR-cas9系統(tǒng)建立TGF-β1敲除的B16細(xì)胞系的過(guò)程

三、敲除TGF-β1后B16的增殖能力情況

克隆形成實(shí)驗(yàn)或集落形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成集落的能力，可反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。為了檢測(cè)TGF-β敲除后對(duì)B16細(xì)胞平板克隆形成能力是否有影響，將三組細(xì)胞集落形成能力進(jìn)行了對(duì)比。發(fā)現(xiàn)在種植1000個(gè)細(xì)胞后一周（如圖3）三組的克隆形成率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如表1）。隨后使用SNK法兩兩比較后發(fā)現(xiàn):TGF-β1-組的克隆形成率明顯小于載體對(duì)照組，而載體對(duì)照組小于對(duì)照組。但是兩周后（表1，圖4），三組克隆形成率差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TGF-β-組的細(xì)胞克隆形成率與對(duì)照組相同，并且均大于載體對(duì)照組。與此同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雖然TGF-β-組的克隆形成數(shù)量多，但是克隆的直徑很小且與其他兩組有差異（表1），使用SNK法兩兩比較后TGF-β-組的克隆直徑小于其對(duì)照組與載體對(duì)照組。所以TGF-β1敲除后，對(duì)B16細(xì)胞平板克隆形成能力總體并沒(méi)有受到影響。

圖2　三組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

表1 種植不同時(shí)間后三組細(xì)胞平板克隆情況（±s）

表1 種植不同時(shí)間后三組細(xì)胞平板克隆情況（±s）

注:與對(duì)照組比較aP＜0.05，與載體對(duì)照組比較bP＜0.05

分組　1周克隆形成率　2周克隆形成率　2周克隆直徑（μm）對(duì)照組　0.633 ± 0.041　0.489 ± 0.064　4.243 ± 0.113載體對(duì)照組　 0.489 ± 0.034a　0.370 ± 0.005a　4.365 ± 0.101 TGF-β1-組　 0.067 ± 0.032ab　0.443 ± 0.012　3.188 ± 0.022abF 值　198.710　7.599　160.734 P 值　0.000　0.020　0.000

四、TGF-β敲除后對(duì)B16的錨著獨(dú)立生長(zhǎng)能力

為了解TGF-β1敲除后B16體外的錨著獨(dú)立生長(zhǎng)能力，本實(shí)驗(yàn)觀察了三組細(xì)胞的軟瓊脂形成率（圖5）。統(tǒng)計(jì)分析后顯示三組細(xì)胞體外克隆形成率的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=65.39，P＜0.0001），SNK法兩兩比較后顯示:對(duì)照組的形成率（0.008±0.0001）低于載體對(duì)照組（0.012±0.0006）與TGF-β1-組（0.012±0.0007）。從此結(jié)果可以看出，B16的軟瓊脂克隆能力經(jīng)過(guò)CRISPR-cas9系統(tǒng)處理后其錨著獨(dú)立生長(zhǎng)是增加的，這種增加與TGF-β1是沒(méi)有關(guān)系的，只是實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞性質(zhì)的影響。

圖3 觀察一周后三組細(xì)胞平板克隆形成能力（甲基紫染色）

圖4 觀察兩周后三組細(xì)胞平板克隆形成能力（甲基紫染色）

五、TGF-β1敲除后的黑色素瘤細(xì)胞侵襲能力

為了解TGF-β1對(duì)B16細(xì)胞侵襲能力的影響，本實(shí)驗(yàn)使用鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室，最后通過(guò)結(jié)晶紫染色后，利用分光光度計(jì)來(lái)計(jì)算被染色細(xì)胞的數(shù)目，被染色細(xì)胞也就是穿過(guò)膠與Transwell膜的細(xì)胞，此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)能較為準(zhǔn)確的驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［24］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三組細(xì)胞穿過(guò)Transwell膜與基質(zhì)膠的數(shù)目之間的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.34，P=0.0002，圖6）。進(jìn)一步SNK法兩兩比較后發(fā)現(xiàn):TGF-β1-組穿過(guò)的B16細(xì)胞數(shù)目（12±4.359）明顯的低于對(duì)照組（101±18.735）與載體對(duì)照組細(xì)胞（100±8.889）。因而敲除TGF-β1基因后，B16細(xì)胞的侵襲能力受到了明顯的抑制。

圖5 三組細(xì)胞軟瓊脂克隆示意圖（甲基紫染色）

圖6 光學(xué)顯微鏡下觀察三組細(xì)胞侵襲能力（結(jié)晶紫染色×4）

圖7 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移能力（結(jié)晶紫染色×4）

六、敲除TGF-β1后的黑色素瘤細(xì)胞的遷移能力

為了觀察TGF-β1敲除后是否對(duì)B16細(xì)胞的體外遷移能力有影響［6］，使用Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)B16的遷移能力。結(jié)果顯示三組細(xì)胞遷移細(xì)胞的數(shù)目差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.34，P＜0.0001，圖7）。SNK法兩兩比較后發(fā)現(xiàn):TGF-β1-組的B16通過(guò)Transwell膜的細(xì)胞數(shù)量（2.037±0.132）明顯的小于對(duì)照組（4.07±0.481）與載體對(duì)照組（8.683 ±1.017）。本實(shí)驗(yàn)表明失去TGF-β1表達(dá)的B16細(xì)胞的遷移能力明顯減弱。

結(jié) 論

皮膚中的黑色素位于表皮的基底層，來(lái)自能動(dòng)的神經(jīng)嵴祖細(xì)胞，這種細(xì)胞在機(jī)體發(fā)育的過(guò)程中不斷的游走［25］。神經(jīng)嵴祖細(xì)胞在胚胎發(fā)育早期游走的過(guò)程中會(huì)發(fā)生EMT，接著會(huì)分化成為各種各樣的細(xì)胞，包括黑色素細(xì)胞。TGF-β信號(hào)通路在調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）方面發(fā)揮著重要的作用，它可調(diào)節(jié)黑色素合成，并且控制著癌癥的性狀以及發(fā)展進(jìn)程［26］。

黑色素瘤細(xì)胞潛在的侵襲性和轉(zhuǎn)移性反映了其恢復(fù)低分化、神經(jīng)嵴樣特征的一個(gè)能力［27］。也就是說(shuō)可能是由于TGF-β調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)祖細(xì)胞的分化過(guò)程出現(xiàn)了阻礙。為研究TGF-β在黑色素瘤中的作用，本研究在黑色素瘤細(xì)胞系中使用CRISPR敲除TGF-β1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B16細(xì)胞的體外遷移能力、侵襲能力均減弱。其機(jī)制可能是由于細(xì)胞的遷移是癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的基礎(chǔ)，它們快速“變形蟲”樣的遷移是癌癥侵襲的基礎(chǔ)，這種現(xiàn)象的發(fā)生主要是高濃度的肌動(dòng)蛋白的參與［28］。細(xì)胞“變形蟲”樣的遷移是由細(xì)胞外信號(hào)與持續(xù)的時(shí)間共同作用，其機(jī)制還不清楚［29］。TGF-β會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的變形蟲樣，比如細(xì)胞的形狀，細(xì)胞膜起泡、高水平的收縮力和遷移能力的增加，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)變形蟲樣的黑色素瘤細(xì)胞TGF-β高表達(dá)［30-31］。TGF-β可以促進(jìn)EMT，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。所以當(dāng)B16中沒(méi)有TGF-β1表達(dá)時(shí)，EMT與變形蟲樣的遷移受到抑制，B16細(xì)胞的體外遷移能力減弱。黑色素瘤細(xì)胞有一種與生俱來(lái)的游走能力［32-33］，在黑色素瘤中TGF-β—SMAD—CITED1途徑通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活控制細(xì)胞的變形習(xí)慣，最終可導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞從角蛋白細(xì)胞分離，潛在的增加其侵襲能力，TGF-β的這個(gè)作用也是依靠EMT［34］。所以本研究在B16細(xì)胞系中敲除了TGF-β1，抑制EMT導(dǎo)致了角蛋白分離較少，敲除TGF-β1的B16細(xì)胞體外的侵襲能力明顯的減弱。本研究為黑色素瘤的防治提供了新的有效途徑。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過(guò)短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過(guò)長(zhǎng)短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長(zhǎng)，進(jìn)入平臺(tái)期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述TGF-β1對(duì)B16細(xì)胞整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，筆者繪制其生長(zhǎng)曲線，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)目并沒(méi)有差異性，所以可知在敲除TGF-β1的B16細(xì)胞系中其細(xì)胞的活力并沒(méi)有受到影響。以前的研究已經(jīng)證明TGF-β1抑制人黑色素瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)［35］，但是相反，TGF-β1處理后的小鼠黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞活度沒(méi)有變化［36］。本研究細(xì)胞系為小鼠黑色素瘤細(xì)胞系，在敲除TGF-β1后其增殖能力、細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，與之前的研究結(jié)果一致。所以TGF-β1調(diào)節(jié)細(xì)胞系的生長(zhǎng)的能力是由細(xì)胞系的種類決定的。

綜上所述，本研究成功建立了TGF-β1敲除的小鼠黑色素瘤細(xì)胞系，并且發(fā)現(xiàn):當(dāng)B16失去表達(dá)TGF-β1后，其侵襲能力與遷移能力減弱，生長(zhǎng)曲線與增殖能力并沒(méi)有受到影響。癌癥的發(fā)生與發(fā)展是由許多因素共同決定的。已經(jīng)證明TGF-β既可以抑制又可以促進(jìn)癌癥活性。結(jié)合本研究的成果分析，此種說(shuō)法的原因可能是:在人上皮性的細(xì)胞系中TGF-β1是促進(jìn)增殖的，由于細(xì)胞系本身的差異，TGF-β1在不同細(xì)胞系中發(fā)揮的作用并不一致，本研究證明TGF-β1在B16中對(duì)其增殖與生長(zhǎng)能力是沒(méi)有影響的。抑制作用主要表現(xiàn)在:TGF-β1敲除后的B16細(xì)胞系其侵襲與遷移能力減弱。

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（本文編輯:陳媛媛）

Used CRISPR-cas9 system to study the effect of TGF-β1 on mouse melanoma cell lines

Wang Ping， Ma Yujie， Wang Qinghua， Lu Jun， Tan Jianming. Organ Transplant Institute， Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command， Fuzhou 350025， China
Corresponding author: Tan Jianming， Email: tanjm156@xmu.edu.cn

Objective To investigate the changes on proliferation， invasive and migration of mouse melanoma cell line（B16）cells after CRISPR-mediated transforming growth factor-beta1 genes disruption. Methods Used CRISPR-cas9 system to establish the mouse melanoma cell lines that knockout TGF-beta1.Cell culture and Count method using test cell growth for control， vector control and TGF-beta1 knockout cell groups， respectivly. Used plate clone and soft agar clone to study proliferation for three different groups. Respectively，using Transwell Chambers and add matrix Transwell Chambers tests migration and invasion ability of three groups of cell. Results Successfully established B16 cell line that knockout TGF-beta1. Growth curve within 24， 48， 72 and 96 h measured cell numbers between threegroup were not significant statistically（P＞0.05）. After one week the plate clone result shows TGF-beta1 konckout group（0.067 ± 0.032） of clone formation rate is less than vector control group（0.489 ± 0.034）and vector control is less than the control group（0.633±0.041），F(xiàn)=198.710，P=0.000；After two weeks，TGF-beta1 knockout group（0.443±0.012）for cell clone formation rate is the same as the control group（0.489±0.064）and they were greater than the vector control group（0.370±0.005），F(xiàn)=7.599，P=0.023，We also found although TGF-beta1 knockout group have a larger clone formation rate， but the diameter of the cloning is less than the other two control groups； Number of soft agar cloning formation rate of the contol group （0.008±0.0001）is lower than in vector control（0.012±0.0006）and TGF-beta1 knockout groups（0.012±0.0007），F(xiàn)=65.39，P＜0.0001. Invasive ability experiment shows， the cells of transfor membrane of TGF-beta1 knockout group（12±4.359）was obviously lower than anoter control groups（101±18.735，100±8.889），F(xiàn)=52.34，P=0.0002； Migration ability experiment results showed that the cells of transfor membrane of TGF-beta1 knockout group （2.037±0.132）was also obviously lower than another control groups（4.07±0.481， 8.683±1.017），F(xiàn)=81.34，P＜0.0001.Conclusion Invasion and migration ability of mice melanima cells that knockout TGF-bata1 has been inhibited， but Growth and proliferation ability were not be affected.

Mice； Melanima； Transforming growth factor beta； Cell culture techniques

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.001

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院杰出青年基金（2015Q03）；福建省重大專項(xiàng)專題（2012YZ0001-1）

350025 福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍器官移植研究所

譚建明，Email: tanjm156@xmu.edu.cn

2016-02-22）