楊洋　王樹玉　周麗穎　白萬凱

[摘要]目的：運(yùn)用基于8位點(diǎn)的PCR-熒光探針法檢測人Y染色體AZF區(qū)微缺失情況，分析其結(jié)果的可靠性并探討其對嚴(yán)重少精或無精癥患者的臨床意義。方法：隨機(jī)抽取150例嚴(yán)重少精或無精子癥患者的外周血，分別運(yùn)用PCR-熒光探針法和多重PCR凝膠電泳法進(jìn)行檢測Y染色體微缺失AZFa、AZFb、AZFc和AZFd區(qū)共8個位點(diǎn)，統(tǒng)計其缺失情況，并分析兩方法檢驗結(jié)果的一致性。結(jié)果：Y染色體微缺失總發(fā)生率為6.00%，非梗阻性無精子癥組為9.26%；嚴(yán)重少精子癥組為4.17%，PCR-熒光探針法和PCR-電泳法檢測結(jié)果完全一致。結(jié)論：Y染色體AZF區(qū)與精子生成關(guān)系密切，嚴(yán)重少精子癥或非梗阻性無精子癥男性行輔助生殖技術(shù)前應(yīng)篩查其微缺失情況；PCR-熒光探針法檢測人Y染色體AZF區(qū)微缺失穩(wěn)定快捷，結(jié)果可靠。

[關(guān)鍵詞]熒光定量PCR；Y染色體微缺失；男性不育

[中圖分類號]R698+.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

已婚孕齡夫婦中不孕不育癥的發(fā)病率約為15%，其中男性因素約占50%。由遺傳缺陷引起的精子發(fā)育障礙約占男性不育的30%以上，而Klinefelter綜合征與Y染色體微缺失是最主要的遺傳性因素。2015年我國男性生殖遺傳學(xué)檢查專家共識中指出，非梗阻性無精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者，建議進(jìn)行Y染色體微缺失檢測（包括AZFa、AZFb、AZFc和AZFd區(qū)共8個位點(diǎn)），這對男性生殖遺傳學(xué)臨床治療、提高輔助生殖技術(shù)的療效和安全性以及開展胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）等具有重要意義。

目前，Y染色體微缺失的檢測方法主要在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上展開。國內(nèi)臨床實驗室多依據(jù)歐洲男科學(xué)協(xié)會/歐洲分子遺傳試驗質(zhì)控協(xié)作網(wǎng)提出的方案，采集外周血標(biāo)本進(jìn)行多重PCR凝膠電泳檢測。該技術(shù)耗時長、存在操作污染風(fēng)險、結(jié)果判定主觀性較大，不太適應(yīng)目前臨床科室需要。本研究使用PCR-熒光探針法檢測150例非梗阻性無精子癥和嚴(yán)重少精患者的Y染色體AZF區(qū)8個位點(diǎn)的微缺失情況，比較其與傳統(tǒng)多重PCR凝膠電泳法所測結(jié)果的優(yōu)劣，并探討不育男性Y染色體微缺失發(fā)生率及其與精子生成的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

連續(xù)收集我院生殖門診無精子癥及嚴(yán)重少精子癥（濃度<5×10⁶/mL）患者150例，根據(jù)WHO人類精液檢驗與處理實驗室手冊（2010）檢測精液至少2次，無精子癥患者精液須離心鏡檢確診，并排除Klinefelter綜合征、小睪癥、梗阻性無精子癥、既往睪丸外傷、惡性腫瘤術(shù)后放化療、重度精索靜脈曲張及隱睪者。簽署知情同意書，采取其外周血并EDTA抗凝。

1.2 實驗方法

根據(jù)GenBank公布的STS位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增方法，將同一患者的兩份外周血標(biāo)本分別使用基于8位點(diǎn)（包括AZFa、b、c、d區(qū)）的PCR-熒光探針法（人Y染色體AZF區(qū)微缺失核酸檢測試劑盒，北京愛普益生物科技有限公司）與多重PCR凝膠電泳法進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

兩組檢測結(jié)果進(jìn)行配對卡方檢驗及進(jìn)行一致性檢驗（Kap-pa檢驗），分析兩種方法檢測結(jié)果的一致性。設(shè)定Kappa值若≥0.75，一致性較好；若<0.40，一致性不理想。

2 結(jié)果

2.1 PCR-熒光探針法與PCR凝膠電泳法檢測STS缺失一致性分析

使用多重PCR凝膠電泳法與PCR-熒光探針法分別檢測150例外周血標(biāo)本，二者在檢出率及檢出位點(diǎn)方面完全一致。配對卡方檢驗顯示，與PCR-電泳法比較，PCR-熒光探針法的檢測結(jié)果二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對檢測結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗（Kappa檢驗），結(jié)果顯示Y染色體AZF區(qū)8個STS位點(diǎn)的P值及Kappa值均為1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即PCR-熒光探針法與PCR-凝膠電泳法檢測AZF區(qū)微缺失位點(diǎn)無差異，二者一致性好。兩組方法檢測Y染色體AZF區(qū)微缺失符合情況見表1。

2.2 不同組別患者Y染色體微缺失情況分析

150例受試者中，非梗阻性無精子癥54例，檢出Y染色體微缺失6例：嚴(yán)重少精子癥96例，檢出4例。其中，1例8位點(diǎn)及SRY全缺失者，之后測得其染色體核型為46，XX。見表2。

3 討論

1976年Tiepolo等發(fā)現(xiàn)了無精子癥患者Y染色體長臂的微缺失并提出了無精子癥基因（azoospermia factor，AZF）的概念。之后Vogt等在Vq11的遠(yuǎn)端確定了AZFa、AZFb、AZFc3個區(qū)域。1999年Kent等認(rèn)為在AZFb區(qū)與AZFc區(qū)之間還存在AZFd區(qū)。

AZF的缺失或突變可能導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，在Yq11區(qū)段或更遠(yuǎn)區(qū)段的丟失或這個區(qū)段中間的微小缺失均會導(dǎo)致精子發(fā)生過程中不同階段的生精障礙引起少精子癥或無精子癥，從而導(dǎo)致不育。不育患者中，AZF缺失者約占3%～29%，發(fā)生率僅次于Klinefelter綜合征，是居于第二位的遺傳因素。

常規(guī)染色體核型分析無法檢測這種Y染色體長臂微缺失。目前通常采用外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞PCR檢測，且學(xué)術(shù)界推薦進(jìn)行包括AZF4個區(qū)域共8個位點(diǎn)的檢測，即sY84及sY86、sY127及sY134、sY254及sY255、sY145及sY152。目前研究普遍認(rèn)為，AZFa區(qū)缺失通常導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征（SCOS），睪丸活檢不能取得精子，建議供精人工授精（artificial insemination bydonor，AID）。AZFb區(qū)或AZFb+c區(qū)缺失表現(xiàn)為生精阻滯，患者多為無精子癥，建議行AID。單獨(dú)AZFc區(qū)缺失最多見。在嚴(yán)重少精子癥或無精子癥中，其缺失率可以達(dá)到5.9%～11.2%，且臨床表現(xiàn)多變，可以為正常精子數(shù)目、少精子癥或無精子癥；據(jù)此也有學(xué)者認(rèn)為AZFc區(qū)缺失可能是一種多態(tài)性表現(xiàn)。對于AZFc區(qū)缺失的無精子癥患者，可以行睪丸手術(shù)取精獲得精子行ICSI，不過AZFc微缺失可以遺傳給其男性后代。對于AZFc區(qū)缺失合并嚴(yán)重少精子癥患者，可以ICSI或PGD選擇女孩，以避免遺傳缺陷的垂直傳播。

AZFd區(qū)缺失的臨床意義尚存爭議。有研究報道sY145及sY152可能與精子形態(tài)異常相關(guān)，其缺失可能導(dǎo)致少精子癥或者精子形態(tài)異常。臨床實際工作發(fā)現(xiàn)，按照《WHO人類精液檢驗與處理實驗室手冊（2010）》嚴(yán)格形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)檢測，嚴(yán)重少精子癥患者大多同時為畸形精子癥。與Mtisltimanoglu研究結(jié)果不盡相同，本研究發(fā)現(xiàn)，AZFd區(qū)sY145并非經(jīng)常與sY152位點(diǎn)同時缺失，AZFd區(qū)缺失多伴AZFb區(qū)或AZFc區(qū)同時發(fā)生：sY145多伴AZFb區(qū)缺失，表現(xiàn)為無精子癥；而sY152則多伴AZFc區(qū)缺失，多表現(xiàn)為無精子癥或嚴(yán)重少弱精子癥。對于其臨床表型特點(diǎn)尚不突出，所以，其機(jī)理研究有賴于樣本量的提高，以及更多的AZF缺失篩查。

Y染色體微缺失目前常用的檢測方法有多重PCR凝膠電泳法、熒光定量PCR法、基因芯片法和熒光原位雜交法等。多重PCR凝膠電泳法作為傳統(tǒng)研究方法耗時長、易污染、結(jié)果判讀較為主觀。熒光定量PCR技術(shù)在加強(qiáng)臨床檢驗質(zhì)量控制同時，因其靈敏度、特異性及檢測速度等方面的優(yōu)勢，已成為臨床實驗室的選擇趨勢。本研究運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測效果好，客觀快速、結(jié)果穩(wěn)定，也驗證了該技術(shù)的優(yōu)勢。

我國男性生殖遺傳學(xué)檢查專家共識建議，非梗阻性無精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者應(yīng)進(jìn)行AZF染色體微缺失檢測：原因不明的男性不育患者可選擇性行Y染色體微缺失檢測：有相關(guān)家族史者，應(yīng)進(jìn)行篩查。另外，筆者臨床工作中發(fā)現(xiàn)數(shù)例精子濃度基本正常但篩查染色體為小Y（Y<21）的患者，追查發(fā)現(xiàn)其AZFc區(qū)缺失，提示某些染色體異常如Y<21者也應(yīng)篩查Y染色體微缺失。

總之，Y染色體微缺失檢測對男性遺傳咨詢、生殖安全和臨床男性不育治療手段的選擇具有重要的意義；熒光定量PCR技術(shù)是檢測Y染色體微缺失的優(yōu)選方法。

（收稿日期：2016-02-29）