樓向明　劉文華　費(fèi)小陽

[摘要]目的：探究外周血及蛻膜組織中CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及相關(guān)炎癥因子對原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響。方法：選取2014年5月至2015年5月就診于我院門診的原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）患者90例為觀察組，并選取同期在婦產(chǎn)科門診手術(shù)室的行人工流產(chǎn)手術(shù)的正?；颊?0例為對照組：分析兩組患者的一般資料、外周血及蛻膜組織中CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異調(diào)節(jié)因子Foxp3和EBi3的表達(dá)以及血清炎癥因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10）水平，研究其相關(guān)性。結(jié)果：與正常妊娠組相比，反復(fù)流產(chǎn)組外周血及蛻膜組織中Treg細(xì)胞比例明顯降低，F(xiàn)oxp3和EBi3因子mR-NA的表達(dá)水平明顯降低，且無論URSA患者或者是正常對照組，蛻膜中各因子的表達(dá)均高于外周血中的表達(dá)，外周血TNF-α、IL-2水平明顯升高，而IL-6和IL-10水平要明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：蛻膜中各因子的表達(dá)均高于外周血中的表達(dá)提示妊娠過程的主要免疫反應(yīng)部位是“母-胎界面”，Treg細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞因子和Th2型因子IL-6、IL-10水平可能參與妊娠的維持，調(diào)控“母-胎界面”局部免疫耐受。對于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病過程具有一定的影響作用。

[關(guān)鍵詞]CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；炎癥因子

[中圖分類號]R714.21 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

近年來，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的發(fā)病率正在逐年增加，RSA是指連續(xù)發(fā)生2次及2次以上的自然流產(chǎn)，其發(fā)生率在1%～5%左右，使得患者的身心健康、日常生活和工作都受到極大的負(fù)面情緒影響。RSA主要與解剖、內(nèi)分泌、感染、遺傳以及外界環(huán)境等因素相關(guān)，然而臨床上仍有50%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)原因不明，稱為原因不明性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（un-explmned recurrent spontaneous aboartion，RSA），免疫微環(huán)境失調(diào)在其中扮演重要的角色。研究表明，Th1型因子（如IL-2、TNF-α等）和Th2型因子（如IL-6、IL-10等）構(gòu)成了蛻膜局部細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，CD4⁺T輔助細(xì)胞亞群中Th1/Th2細(xì)胞的比例在免疫平衡的維持中起重要作用。CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）主要發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)節(jié)的作用，起抗炎和維持自身免疫耐受的作用，F(xiàn)oxp3和EBi3是Treg細(xì)胞的特異性調(diào)節(jié)因子，對Treg細(xì)胞的發(fā)育和免疫抑制功能的維持具有重要作用。本研究通過檢測URSA患者和正常早孕婦女外周血Th1型因子和Th2型因子水平、外周血及蛻膜組織中Treg細(xì)胞比例的變化以及Foxp3和EBi3的表達(dá)水平，探討相關(guān)性，為URSA的治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例來源于2014年5月至2015年5月就診于我院門診的URSA患者90例和同期在婦產(chǎn)科門診手術(shù)室的行人工流產(chǎn)手術(shù)的正常患者90例。URSA病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡<40歲；（2）有2次或2次以上自然流產(chǎn)史；（3）夫婦雙方身體健康，且復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因經(jīng)普通檢查無法明確：（4）入組患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）內(nèi)分泌和免疫相關(guān)疾??；（2）器質(zhì)性病變及感染性因素；（3）家族遺傳病及近親結(jié)婚史；（4）服用藥物或有害物質(zhì)接觸史。對照組病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡<40歲：（2）妊娠小于12周；（3）B超檢查證實(shí)胚胎發(fā)育正常。（4）夫婦雙方身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往無自然流產(chǎn)以及死胎史（2）患有器質(zhì)性病變、內(nèi)分泌和免疫相關(guān)疾病；（3）感染性疾病以及肝腎疾病病史。觀察組：年齡20～38歲，平均（27.5±3.1）歲，流產(chǎn)次數(shù)2～7次，平均（3.1±1.2）次，流產(chǎn)時平均孕周（8.1±0.8）周，月經(jīng)第3d性激素五項水平正常；對照組：年齡19～39歲，平均（28.4±3.5）歲，平均孕周（7.9±1.5）周，月經(jīng)第3d性激素五項處于正常水平。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組患者的年齡、孕周、月經(jīng)第3d性激素五項等一般資料均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

用抗凝管抽取兩組患者外周靜脈血，離心分離血清與血細(xì)胞，收集兩組患者行人工流產(chǎn)術(shù)時取出的蛻膜，酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法（ELISA）法測定血清炎癥因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10）水平，逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測患者外周血及蛻膜組織中Foxp3和EBi3因子mRNA的表達(dá)，雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血及蛻膜組織中Treg細(xì)胞比例。

1.3 觀察指標(biāo)

分析兩組患者的一般資料、外周血及蛻膜組織中Treg細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞特異調(diào)節(jié)因子Foxp3和EBi3的表達(dá)以及血清炎癥因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10）水平，詳細(xì)記錄后做出對比分析，研究其相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，定性資料采用獨(dú)立樣本R×C列聯(lián)表資料的x²檢驗(yàn)；定量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用配對設(shè)計資料的t檢驗(yàn)或兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)，按α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較

納入樣本為就診于我院門診的URSA患者90和同期在婦產(chǎn)科門診手術(shù)室的行人工流產(chǎn)手術(shù)的正?；颊?0例。兩組一般資料具有均衡性（P>0.05）。見表1。

2.2 兩組外周血及蛻膜組織中Treg細(xì)胞比例比較

與正常妊娠組相比，反復(fù)流產(chǎn)組外周血及蛻膜組織中Treg細(xì)胞比例明顯降低，蛻膜中Treg細(xì)胞比例高于外周血，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。意義（P<0.05）。見表3。

2.3 兩組外周血及蛻膜組織中Foxp3和EBi3因子mRNA的表達(dá)水平比較

與正常妊娠組相比，反復(fù)流產(chǎn)組外周血及蛻膜組織中Foxp3和EBi3因子mRNA的表達(dá)水平明顯降低，蛻膜組織中Foxp3和EBi3因子mRNA表達(dá)水平高于外周血，差異有統(tǒng)計學(xué)

2.4 兩組外周血及Th1型因子和Th2型炎癥因子水平比較

與正常妊娠組相比，反復(fù)流產(chǎn)組外周血TNF-α、IL-2水平明顯升高，而IL-6和IL-10水平要明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

URSA的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前存在較多的探索和嘗試性的治療，結(jié)果的矛盾導(dǎo)致巨大的爭議。研究表明，妊娠階段是一個特殊的、復(fù)雜的生理階段，伴隨著在心理、生理和免疫功能的變化，我們可以將胎兒看作是在母體內(nèi)生長、發(fā)育和成形的一種同種的抗原，并在母體免疫應(yīng)答的保護(hù)作用下生長，一直持續(xù)到胎兒順利地分娩，這種使胎兒不被排斥的現(xiàn)象是由很多因素共同作用產(chǎn)生的效果，分布在母胎界面的T細(xì)胞（Th細(xì)胞）包括Th1/Th2型細(xì)胞因子成為研究者的觀察目標(biāo)，最近的研究發(fā)現(xiàn)，這種模式不能完全反映體內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，胎兒的植入過程從粘連、定位、血管生成、侵入過程涉及復(fù)雜和精確的調(diào)節(jié)。有學(xué)者認(rèn)為，并非僅有Th1/Th2類細(xì)胞因子參與了免疫耐受的形成，Treg細(xì)胞以及Treg細(xì)胞因子對母-胎免疫耐受的形成起著至關(guān)重要的作用。

Th1型免疫反應(yīng)與Th2兩型免疫反應(yīng)主要調(diào)節(jié)調(diào)控“母-胎界面”局部免疫耐受，將耐受與排斥現(xiàn)象保持在一個相對平衡的狀態(tài)中。在懷孕初期，TNF-α、IL-2作為Th1型細(xì)胞因子代表，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、衰老、凋亡細(xì)胞增殖以及機(jī)體能量代謝，為胎兒的生長發(fā)育提供了相對良好的環(huán)境。At-slan等發(fā)現(xiàn)Th1型細(xì)胞因子促進(jìn)孕婦體內(nèi)的激素合成包括孕酮和人絨毛膜促性腺激素，促進(jìn)胎盤的植入；然而過高的Th1型細(xì)胞因子水平對于胎兒發(fā)育過程也構(gòu)成威脅性，在很大程度上增加了胚胎植入過程的難度。作為Th2型細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-6發(fā)現(xiàn)通過刺激B細(xì)胞影響母體的免疫系統(tǒng)降低排斥作用，胚胎進(jìn)入子宮后，母胎之間適應(yīng)性與相容性則受到IL-10的調(diào)控。Treg通過細(xì)胞間接觸抑制和分泌抑制性細(xì)胞因子等抑制傳統(tǒng)T細(xì)胞的活化從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定并誘導(dǎo)移植物的耐受。Foxp3是Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對Treg細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育、在外周的分布以及免疫抑制功能的維持具有重要作用，F(xiàn)oxp3含量可以調(diào)控母胎界面免疫耐受的形成，促使妊娠向好的結(jié)局發(fā)展。

本研究中發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠組相比，反復(fù)流產(chǎn)組外周血及蛻膜組織中Treg細(xì)胞比例明顯降低，F(xiàn)oxp3和EBi3因子mRNA的表達(dá)水平明顯降低，且無論URSA患者或者是正常對照組，蛻膜中各因子的表達(dá)均高于外周血中的表達(dá)，外周血TNF-α、IL-2水平明顯升高，而IL-6和IL-10水平要明顯降低蛻膜中各因子的表達(dá)均高于外周血中的表達(dá)提示妊娠過程的主要免疫反應(yīng)部位是“母-胎界面”，Treg細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞因子和Th2型因子IL-6、IL-10水平可能參與妊娠的維持，調(diào)控“母-胎界面”局部免疫耐受，于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病過程具有一定的影響作用。

綜上所述，URSA的發(fā)生和發(fā)展是一個極其復(fù)雜和綜合的免疫學(xué)過程，我們需要從不同角度如Th1/Th2型細(xì)胞因子、Treg細(xì)胞以及Treg細(xì)胞因子等方面對URSA患者的治療進(jìn)行更多的研究，從而確立治療URSA的有效方法。

（收稿日期：2015-08-05）